犬傳染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬的體液免疫效果研究.pdf

1、目的：犬傳染性肝炎（Infectious canine hepatitis ICH）是由犬傳染性肝炎病毒（ICHV）引起的一種常見的急性敗血性傳染病，傳染性強(qiáng)，無(wú)明顯季節(jié)性，各種品系，不同年齡的犬均可被感染，尤其以六周齡至一歲以內(nèi)的犬發(fā)病率高，死亡率達(dá)10～40％，對(duì)養(yǎng)犬業(yè)和實(shí)驗(yàn)犬的飼養(yǎng)均可造成極大的危害。預(yù)防本病發(fā)生的主要措施就是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格獸醫(yī)衛(wèi)生措施和定期免疫接種。目前，在實(shí)驗(yàn)用犬和其他養(yǎng)犬業(yè)，主要采取定期接種ICtⅣ弱毒疫

2、苗的方法。
　　 核酸疫苗是近年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫技術(shù)，與傳統(tǒng)疫苗相比有諸多優(yōu)點(diǎn)，被稱為第三代疫苗。核酸疫苗免疫接種后，可在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。抗體是由抗原刺激B細(xì)胞經(jīng)分化和增殖后產(chǎn)生的免疫球蛋白，因此在機(jī)體接受免疫接種以后，檢測(cè)機(jī)體的抗體水平，成為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫反應(yīng)及疫苗免疫效果的一個(gè)重要體液免疫指標(biāo)。中和抗體是病原微生物侵襲機(jī)體后，所產(chǎn)生的具有中和相應(yīng)病原微生物及其毒性產(chǎn)物（毒素），使病原微生

3、物喪失感染能力或毒力的抗體，是進(jìn)行病毒感染機(jī)制研究的重要工具。中和抗體水平的監(jiān)測(cè)是反映疫苗免疫原性的一個(gè)重要體液免疫指標(biāo)。
　　 核酸疫苗作為一種新興的疫苗，大量實(shí)驗(yàn)表明在感染性疾病、腫瘤等的預(yù)防和治療方面具有很大的潛力。本研究室采用基因重組技術(shù)構(gòu)建了含有Loop1、Loop2的重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop免疫小鼠后，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)抗原的特異性IgG抗體和抑制病毒感染的中和抗體。為確定此核酸疫苗對(duì)犬的免疫應(yīng)答效果，本研

4、究采用pVAX1-CpG-Loop對(duì)Beagle犬進(jìn)行免疫，對(duì)其體液免疫應(yīng)答效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。旨在探索pVAX1-CpG-Loop作為預(yù)防犬傳染性肝炎核酸疫苗的有效性，為犬傳染性肝炎病毒核酸疫苗的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、質(zhì)粒的提取及抗原蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
　　 采用SDS-堿裂解法大量提取重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop，采用聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒。并對(duì)提取的重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Lo

5、op經(jīng)分光光度計(jì)進(jìn)行純度和濃度測(cè)定。將原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a（+）Loop轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），搖菌并誘導(dǎo)重組Loop蛋白的表達(dá)。用尿素溶解沉淀，采用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白，透析、復(fù)性后濃縮目的蛋白。
　　 2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及免疫
　　 6只Beagle犬進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)：1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)犬：分別于0、8、16周注射重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop400μg、600μg、800μg/只/次，最后一次與

6、相同劑量的抗原蛋白共免疫；4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)犬：分別于0、8、16周僅注射重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop400μg、600μg、800μg/只/次，每只動(dòng)物均于免疫前經(jīng)雙側(cè)股四頭肌注射25％滅菌蔗糖1ml/只，15min后于相同部位進(jìn)行質(zhì)粒免疫，抗原蛋白免疫于頸部皮下。7號(hào)犬：為已接種傳統(tǒng)疫苗對(duì)照。
　　 3、攻毒試驗(yàn)
　　 在第3次接種6周后，對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。取病毒株經(jīng)MDCK細(xì)胞增殖，取MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物（

7、TCID50為10-4.23/0.1ml），在麻醉狀態(tài)下，通過(guò)口腔粘膜感染病毒，劑量為1 ml/只。
　　 4、免疫動(dòng)物的體液免疫效果評(píng)價(jià)
　　 間接ELISA法檢測(cè)免疫犬特異性IgG抗體，以包被液稀釋的犬傳染性肝炎病毒（1：5稀釋病毒），100μl/孔包被酶聯(lián)板，4℃過(guò)夜；去除包被液，以PBST洗滌3次，20％胎牛血清-PBST封閉，37℃于濕盒中放置1h；然后加入待檢的不同稀釋度的犬血清100μl/孔，37℃于濕盒中

8、放置1h，洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的兔抗狗IgG抗體（1：2000），37℃于濕盒中放置1h，沈滌3次；加入顯色底物OPD溶液1001μl/孔，避光顯色；加入50μl/孔2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)分析儀檢測(cè)492nm波長(zhǎng)下的OD值（OD492）。以P/N大于1.8為陽(yáng)性。
　　 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）測(cè)定血清抗體效價(jià)，免疫后靜脈采血，分離血清，將待測(cè)血清置56℃滅活30min，血清樣品用PBS稀釋為1：10、1：

9、50、1：100、1：200、1：400、1：8006個(gè)稀釋度，滴加于抗原片上，設(shè)PBS為空白陰性對(duì)照。在37℃溫箱中孵育30min；PBS振蕩洗滌3次，每次5 min；加1：200稀釋度的羊抗犬IgG FITC標(biāo)記物，在37℃溫箱中孵育30min；PBS振蕩洗滌3次，每次5min；加1：2000稀釋度的伊文思藍(lán)，在37℃溫箱中染色30min；PBS振蕩洗滌3次，每次5min；最后用蒸餾水沖洗，室溫吹干；用90％緩沖甘油液封片，在熒光顯

10、微鏡下觀察。
　　 中和試驗(yàn)測(cè)定血清中和抗體效價(jià)：收集各犬的血清，滅活后采用固定病毒.稀釋血清法進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)。用DMEM將血清樣品做連續(xù)倍比稀釋。分別在上述血清中加入等量的適當(dāng)?shù)味鹊牟《荆?00TCID50），充分混勻后置于37℃孵育1h；接種至敏感細(xì)胞（MDCK），100μl/孔，設(shè)兩復(fù)孔，并設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照；37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育1h：棄去血清-病毒混合液，用Hanks液洗滌細(xì)胞3次，加入細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng)3天觀

11、察細(xì)胞病變。
　　 結(jié)果：
　　 1、重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop的大量提取
　　 用堿裂解法大量提取所得的真核重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop經(jīng)分光光度計(jì)進(jìn)行純度和濃度測(cè)定，OD260/OD280分別為1.82、1.9、1.88。
　　 2、Loop蛋白的誘導(dǎo)、表達(dá)和純化
　　 pET28aLoop重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，做SDS-PAGE電泳，誘導(dǎo)表

12、達(dá)菌在36kDa處出現(xiàn)一條蛋白表達(dá)條帶，對(duì)照組無(wú)此條帶。用鎳離子親和層析柱純化表達(dá)蛋白，SDS-PAGE電泳分析，目的蛋白純度在95％至98％之間。
　　 3、間接ELISA測(cè)定免疫犬血清IgG水平
　　 攻毒前各實(shí)驗(yàn)犬產(chǎn)生的特異性抗體無(wú)顯著變化，其中1號(hào)犬及7號(hào)犬所產(chǎn)生的抗體效價(jià)明顯高于其它犬。攻毒后各實(shí)驗(yàn)犬所產(chǎn)生的抗體效價(jià)均明顯增高，7號(hào)犬在第一周達(dá)到最高值，其它實(shí)驗(yàn)犬在第三周達(dá)到最高值，后逐漸下降持續(xù)至27周。

13、r>　　 4、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）測(cè)定免疫犬血清總IgG抗體水平
　　 攻毒前1號(hào)、4號(hào)、5號(hào)和7號(hào)實(shí)驗(yàn)犬檢測(cè)到IgG抗體滴度持續(xù)為1：10，其余實(shí)驗(yàn)犬未檢測(cè)到特異性抗體。攻毒后，在第五天抗體水平開始升高，其中1號(hào)、5號(hào)和7號(hào)犬達(dá)1：50，4號(hào)犬仍為1：10，2號(hào)、3號(hào)和6號(hào)犬未檢測(cè)到IgG抗體。從第一周開始各試驗(yàn)犬抗體水平開始顯著升高，1號(hào)犬和4號(hào)犬在三周達(dá)最高滴度為1：400，其它各犬在第一周達(dá)最高滴度為1：200。

14、各犬抗體逐漸下降持續(xù)至第7周，于第14周檢測(cè)不到抗體。
　　 5、中和試驗(yàn)測(cè)定免疫犬血清中和抗體水平
　　 攻毒前，除7號(hào)犬（中和抗體效價(jià)為1：8）其余各實(shí)驗(yàn)犬均未檢測(cè)到中和抗體。在攻毒后，所有實(shí)驗(yàn)犬自第5天開始檢測(cè)到中和抗體，1號(hào)犬較其它各實(shí)驗(yàn)犬抗體滴度高為1：128；1號(hào)、4號(hào)、5號(hào)和7號(hào)犬在第一周達(dá)最高滴度1：1024，其它各犬在第三周達(dá)其最高滴度，至第五周顯著下降后逐漸下降至第27周。
　　 結(jié)論：