犬傳染性肝炎核酸疫苗對Beagle犬的細(xì)胞免疫效果及免疫機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 犬傳染性肝炎（Infectious canine hepatitis，ICH）是由犬傳染性肝炎病毒（ICHV）又稱Ⅰ型犬腺病毒引起的一種常見的急性敗血性傳染病。本病廣泛分布于世界各地，犬不分品種、年齡和性別，可以全年發(fā)生，但以離乳至一歲以內(nèi)的幼犬的感染率和死亡率最高，對養(yǎng)犬業(yè)和實(shí)驗(yàn)犬的飼養(yǎng)均可造成極大的危害。
　　 目前主要通過接種滅活疫苗和減毒活疫苗預(yù)防ICH的發(fā)生。在疫苗制備過程中病毒的逃逸以及滅活不完

2、全均可造成該病的暴發(fā)。緊急預(yù)防或治療已發(fā)病的病犬可使用同型或異型免疫血清或丙種球蛋白，但對犬的保護(hù)效果有限。
　　 核酸疫苗是90年代從基因治療研究領(lǐng)域發(fā)展起來的一項(xiàng)新的生物技術(shù)，是將作為免疫原的一種或多種蛋白編碼基因克隆到真核表達(dá)載體（質(zhì)粒）上，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒直接注入到體內(nèi)而激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，因此也有人稱其為基因疫苗。它的研究具有深遠(yuǎn)意義，可用于對細(xì)菌、病毒、寄生蟲等多種疾病的防治，其多價(jià)、高效、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)使其潛在的應(yīng)用價(jià)值

3、不可估量。核酸疫苗可能對人類疾病的防治以及畜牧業(yè)的健康發(fā)展起到劃時(shí)代的作用。
　　 本研究室的前期研究工作，用已構(gòu)建的犬傳染性肝炎核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop，免疫BALB/c小鼠后，誘導(dǎo)出了特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，產(chǎn)生具有殺傷表達(dá)病毒抗原靶細(xì)胞的CTL效應(yīng)，顯示出良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證pVAX1-CpG-Loop對本動(dòng)物犬的免疫效果，尋求最佳的免疫劑量和免疫策略，本研究采用已構(gòu)建的犬

4、傳染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，對其免疫效果及免疫機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 方法：
　　 1、用堿裂解法大量提取真核重組質(zhì)粒
　　 將重組質(zhì)粒陽性克隆菌接種于2×YT液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)36h；離心收集菌體。采用SDS-堿裂解法大量提取重組質(zhì)粒，并對提取的重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop進(jìn)行純度和濃度測定。
　　 2、重組Loop蛋白的提取
　　 將原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a（+）

5、Loop轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），搖菌并誘導(dǎo)重組Loop蛋白的表達(dá)。采用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白，透析并復(fù)性后濃縮目的蛋白。
　　 3、重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop免疫Beagle犬
　　 6只已接種兩聯(lián)苗Beagle犬隨機(jī)編為1-6號。1號，2號，3號犬：分別經(jīng)雙側(cè)股四頭肌注射重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop400μg，600μg，800μg/只/次，最后一次與相同劑量的重組Loop蛋白共免疫；4

6、號，5號，6號犬：分別經(jīng)雙側(cè)股四頭肌注射重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop400μg，600μg，800μg/只/次，7號犬：已接種六聯(lián)苗。
　　 以上1-6號犬于免疫前15min均經(jīng)股四頭肌注射25％滅菌蔗糖每側(cè)500μl。分別于0、8、16周免疫，末次免疫后6周，進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。（1號犬稱為pp400，第一個(gè)p代表重組質(zhì)粒plasmid，第二個(gè)p代表重組蛋白protein，400代表400μg；依此類推，2～6號犬分別為pp

7、600，pp800，p400，p600，p800；7號犬為control。）
　　 4、免疫效果評價(jià)
　　 4.1 T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測免疫犬的外周血T淋巴細(xì)胞增殖活性。
　　 4.2蛋白特異性CTL活性分析采用Cyto Tox96非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒進(jìn)行檢測。
　　 4.3淋巴細(xì)胞誘生因子的檢測取5×106/ml的犬外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用犬IFN-γ與犬IL-4定量試劑盒測定標(biāo)

8、本中IFN-Y與IL-4的濃度。
　　 4.4 IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測采用犬IFN-γ ELISpot試劑盒檢測分泌IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)。
　　 4.5 RT-PCR檢測細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)采用RT-PCR檢測細(xì)胞因子IFN-γ和細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、用堿裂解法大量提取重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop，用分光光度計(jì)進(jìn)行純度和濃度測定，OD260/OD280在1

9、.8-2.0之間。誘導(dǎo)表達(dá)的重組Loop蛋白經(jīng)鎳離子親和層析純化，在GuNTA-200咪唑洗脫液中含量最高。
　　 2、在末次免疫后兩周，重組質(zhì)粒免疫犬外周血淋巴細(xì)胞在體外分別經(jīng)ConA和重組Loop蛋白刺激后增殖活性高于對照犬。病毒攻擊后兩周，經(jīng)ConA刺激后，p800免疫犬增殖活性超過攻毒前，明顯高于其他免疫犬。
　　 3、在末次免疫后兩周，重組質(zhì)粒免疫犬CTL殺傷活性均高于對照犬；在病毒攻擊后兩周，pp600及p4

10、00免疫犬CTL殺傷活性高于對照犬。
　　 4、末次免疫后兩周，重組質(zhì)粒免疫犬外周血淋巴細(xì)胞分別經(jīng)ConA和重組Loop蛋白體外刺激后培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子IL-4濃度高于對照犬；攻毒后兩周，單用質(zhì)粒免疫犬IL-4濃度稍高于對照犬。末次免疫后六周，重組質(zhì)粒免疫犬外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度高于對照犬，攻毒后兩周，p400及p600免疫犬外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ濃度升高并高于對照犬。
　　 5、末次免疫

11、后六周，p400免疫犬外周血淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)明顯高于對照犬。
　　 6、RT-PCR檢測細(xì)胞因子的表達(dá)顯示，末次免疫后兩周及攻毒后兩周重組質(zhì)粒免疫犬細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)量均高于對照犬；末次免疫后兩周，重組質(zhì)粒免疫犬有細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)，對照犬無表達(dá)；攻毒后兩周，pp800共免疫犬細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)最高。
　　 結(jié)論：
　　 1、綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在重組質(zhì)粒免疫犬能檢測到外周血淋

12、巴細(xì)胞增殖活性及CTL殺傷活性，也可檢測到能分泌IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，提示重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop免疫犬后能誘導(dǎo)出特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　 2、重組質(zhì)粒免疫犬外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子IL-4的濃度及IL-4在mRNA水平的相對表達(dá)量均達(dá)到對照犬水平，表明重組質(zhì)粒pVAX1-CpG-Loop免疫犬后能誘導(dǎo)出體液免疫應(yīng)答。
　　 3、質(zhì)粒與蛋白共免疫與單用質(zhì)粒免疫犬的免疫效果無明顯差別。單用重組