犬腺病毒pVAX1-Loop核酸疫苗的構(gòu)建、表達(dá)和免疫.pdf

1、目的：犬傳染性肝炎（ICH）是由犬腺病毒Ⅰ型（CAV-1）引起的一種急性敗血性傳染病。該病以1歲以內(nèi)的幼犬為多發(fā)，發(fā)病率和死亡率相對較高，對我國實(shí)驗(yàn)犬的飼養(yǎng)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前主要通過定期接種弱毒疫苗預(yù)防本病發(fā)生，但是弱毒疫苗存在毒力回升、生產(chǎn)成本較高、終生需要定期免疫的缺點(diǎn)。本研究將Loop基因克隆到真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建核酸疫苗pVAX1-Loop，用RT-PCR的方法檢測Loop基因的表達(dá)，用Wester

2、n blotting和激光掃描共聚焦顯微鏡鑒定Loop蛋白的表達(dá)，用重組質(zhì)粒pVAX1-Loop免疫BALB/c小鼠，并檢測其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的細(xì)胞及體液免疫效果。
　　 方法：⑴提取犬腺病毒的DNA，以其為模板擴(kuò)增Loop1和Loop2片段，同時(shí)通過引物設(shè)計(jì)在Loop1片段兩端引入BamHⅠ、SmaⅠ酶切位點(diǎn)，在Loop2片段兩端引入SmaⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)。將Loop1和Loop2的PCR產(chǎn)物回收后用SmaⅠ進(jìn)行酶切，純化，將

3、純化后片段在16℃進(jìn)行連接。⑵重組質(zhì)粒的大量提取取真核重組質(zhì)粒陽性克隆重組菌接種于2×YT液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)36h；離心收集細(xì)菌沉淀。采用SDS-堿裂解法大量提取重組質(zhì)粒pVAX1-Loop。⑶ELISA測定血清抗體效價(jià)免疫3次后的小鼠斷尾采血，分離血清，以犬傳染性肝炎病毒抗原每孔100μg/ml包被酶標(biāo)板，4℃過夜。洗滌封閉后加稀釋的小鼠血清100μl，孵育60min后洗滌加HRP標(biāo)記的二抗孵育60min，OPD顯色。酶標(biāo)儀492nm

4、波長處測吸光度值。
　　 結(jié)果：①目的基因與真核表達(dá)載體經(jīng)酶切及PCR鑒定，構(gòu)建成功。②pVAX1-Loop轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞后，用RT-PCR的方法檢測到預(yù)期的特異性條帶。③pVAX1-Loop轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞后，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察到表達(dá)蛋白顯著的熒光強(qiáng)度。④pVAX1-Loop轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞后，Western blotting結(jié)果顯示表達(dá)蛋白與抗Loop抗體有特異性結(jié)合。⑤間接ELISA檢測顯示，各實(shí)驗(yàn)組小鼠所產(chǎn)生的抗體血

5、清OD值明顯高于注射空質(zhì)粒pVAX1的對照組A組（P<0.05）。⑥免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞分析，各實(shí)驗(yàn)組小鼠CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞構(gòu)成比均高于注射空質(zhì)粒pVAX1的對照組A組（P<0.05）。⑦采用MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖活性，各實(shí)驗(yàn)組小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性均高于注射空質(zhì)粒pVAX1對照組A組（P<0.05）。
　　 結(jié)論：⑴成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pVAX1-Loop。⑵pVAX1-Loop轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞后能夠表達(dá)L