日本腦炎病毒核酸疫苗的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、日本腦炎病毒(Japanesesencephalitisvirus，JEV)又稱(chēng)乙型腦炎病毒，為黃病毒科單股正鏈RNA病毒，基因組約為11kb，僅有一個(gè)開(kāi)放閱讀框(openreadingframe，ORF)，從5’到3’端排列著3個(gè)結(jié)構(gòu)基因(C、prM和E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)基因(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)，分別編碼相應(yīng)的蛋白。JEV是流行性乙型腦炎(簡(jiǎn)稱(chēng)乙腦)的病原體，經(jīng)蚊蟲(chóng)叮咬傳播。乙腦主要流行于亞洲

2、東南亞各國(guó)及遠(yuǎn)東地區(qū)。JEV感染后往往引發(fā)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀，死亡率較高，幸存者亦有半數(shù)以上發(fā)展為永久的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。乙腦尚無(wú)有效的治療手段，因此免疫接種是控制其流行、保護(hù)易感人群的重要措施，并且預(yù)防接種對(duì)于人類(lèi)對(duì)抗JEV感染已發(fā)揮了良好的保護(hù)作用。目前使用的JEV疫苗主要有三種：一種是由日本研發(fā)的滅活疫苗，采用JEV感染的成年鼠腦經(jīng)福爾馬林滅活純化制成；另外兩種由我國(guó)開(kāi)發(fā)研制，分別為原代地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗和經(jīng)SA14-14-2

3、減毒株感染地鼠腎細(xì)胞反復(fù)傳代研制而成的減毒活疫苗，由于生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的原因，后兩者僅局限在中國(guó)境內(nèi)使用。然而三種疫苗均有其局限性：滅活疫苗存在高生產(chǎn)成本、免疫力不持久、需多次注射及存在變態(tài)反應(yīng)等缺陷；而減毒活疫苗則存在毒力回復(fù)的危險(xiǎn)。因此亟待發(fā)展一種安全、有效、質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的新型疫苗用于對(duì)抗JEV引發(fā)的世界范圍內(nèi)的感染。 近年來(lái)，核酸DNA疫苗的出現(xiàn)的是替代傳統(tǒng)疫苗的新興策略，與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗具有較多的優(yōu)點(diǎn)，主要在于：(1)在機(jī)

4、體內(nèi)以類(lèi)似病毒感染的方式合成抗原，從而介導(dǎo)持久的細(xì)胞免疫和體液免疫；(2)DNA疫苗安全穩(wěn)定，易于制備，成本低廉。業(yè)已證明JEV的結(jié)構(gòu)蛋白prM-E和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是保護(hù)性抗原位點(diǎn)集中的部位，將表達(dá)JEV的prM、E或是NS1的質(zhì)粒免疫小鼠后，能夠產(chǎn)生特異性的保護(hù)性免疫，因此認(rèn)為prM-E-NS1基因是JEVDNA疫苗首選靶點(diǎn)。但是單純的DNA疫苗尚不足以引發(fā)良好的免疫效果，為此近年來(lái)出現(xiàn)一個(gè)較新的策略，即在基因水平將細(xì)胞因子與核酸疫

5、苗共同表達(dá)，利用細(xì)胞因子上調(diào)機(jī)體免疫水平的作用，進(jìn)而顯著增強(qiáng)核酸疫苗的效果。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor,GM-CSF)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞及樹(shù)突細(xì)胞(dendriticcell，DC)的浸潤(rùn)、成熟和活化，進(jìn)而提高免疫系統(tǒng)的抗原提呈能力，增加疫苗的免疫原性，GM-CSF已被證實(shí)是良好的基因佐劑。 目前來(lái)源于腦心肌炎病毒(Encephalomy

6、ocarditisvirus，EMCV)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(intemalribosomeentrysite，IRES)序列已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于異源基因的共表達(dá)，因此本研究采用同樣的策略，構(gòu)建了雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體pCAG-JEGM，在同一載體內(nèi)共表達(dá)JEVprM-E-NS1片段和GM-CSF基因，兩者由IRES相連。構(gòu)建成功后，進(jìn)一步在細(xì)胞水平驗(yàn)證了該質(zhì)粒的表達(dá)。本研究的質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程和結(jié)果如下： 構(gòu)建過(guò)程：Beijing-1株感染C

7、6/36細(xì)胞，提取病毒RNA；同時(shí)提取小鼠脾臟總RNA，分別以病毒RNA和脾臟RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增，得到JEVprM-E-NS1片段和GM-CSF片段，進(jìn)而將該兩片段分別插入pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A(multiplecloningsitesA，MCSA)和多克隆位點(diǎn)B(multiplecloningsitesB，MCSB)，陽(yáng)性克隆命名為pIRES-JEGM。經(jīng)XhoI和NotI雙酶切該質(zhì)粒得到prM-E-NS1-IRES

8、-GM-CSF片段，克隆入具有雞β-actin啟動(dòng)子的pCAGGSP7質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證，命名為pCAG-JEGM。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)pCAG-JEGM的保護(hù)性效果，比較表達(dá)細(xì)胞因子和JEV不同基因片段之間產(chǎn)生的保護(hù)性差異，本研究繼續(xù)構(gòu)建了pCAG-JEV3.1k(僅表達(dá)JEVprM-E-NS1片段)和pCAG-prM-E(僅表達(dá)JEVprM-E片段)作為對(duì)照質(zhì)粒。為了避免不同質(zhì)粒之間引起機(jī)體反應(yīng)性不同及表達(dá)效率的差異

9、，對(duì)照質(zhì)粒的構(gòu)建同樣使用了pCAGGSP7質(zhì)粒。 為驗(yàn)證pCAG-JEGM質(zhì)粒病毒蛋白和GM-CSF的表達(dá)，采用脂質(zhì)體(lipofectamine2000)的方法將pCAG-JEGM轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h，間接免疫熒光染色顯示：pCAG-JEGM在細(xì)胞內(nèi)能夠表達(dá)出與JEVmAb具有反應(yīng)性的病毒蛋白；且GM-CSF同時(shí)表達(dá)，能夠被GM-CSFmAb所識(shí)別，換言之，pCAG-JEGM轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以同時(shí)表達(dá)病毒蛋白和GM-

10、CSF，提示pCAG-JEGM構(gòu)建正確。需要說(shuō)明的是與病毒蛋白相比，GM-CSF的表達(dá)量略低。采用相同的方法，pCAG-JEV3.1k和pCAG-prM-E轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，免疫熒光染色顯示，亦能正確表達(dá)病毒蛋白，構(gòu)建正確。 所構(gòu)建的質(zhì)粒pCAG-JEGM、pCAG-JEV3.1k和pCAG-prM-E具有多種細(xì)胞適應(yīng)性，分別將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7、Vero和HepG2細(xì)胞株后，均能正常表達(dá)，各個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率略