日本腦炎病毒核心蛋白編碼基因重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR法構(gòu)建重組質(zhì)粒pJC，并通過間接免疫熒光法探究重組質(zhì)粒pJC在CHO細(xì)胞株中能否進(jìn)行表達(dá)及其分布，為研究日本腦炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白間相互作用及病毒毒力等研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、細(xì)胞、質(zhì)粒及菌株。中華倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞購自中國科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫，生長于37℃，5％CO2及含10％胎牛血清(Fatal calf serum，F(xiàn)C

2、S)的Dulbecco modified eagle medium(D—MEM)高糖培養(yǎng)液中；BALB/c鼠購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；含F(xiàn)LAG片段的JEV C蛋白編碼基因重組質(zhì)粒被命名為pJC，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)購自Invitrogen公司，用于JEVC蛋白編碼基因重組子的構(gòu)建；大腸桿菌JM109與DH5α購自Takara公司，用于重組質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化。 2、試劑及抗體。RNA抽提試劑(Co

3、de No．D312)，RT-PCR試劑盒(Code No．DR027A)，DNA片斷純化試劑盒(Takara，product No．DV807)，DNA A尾試劑盒(Takara，product No。D404)，瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒(Takara，product No．DV805)，DNA連接試劑盒(Takara，product No．D6023)，質(zhì)粒小劑量提取試劑盒(Takara，product No．DV801A)，限制

4、性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI均購自Takara公司，用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建和酶切鑒定。脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)購自Invitrogen公司，用于CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染。氨芐青霉素購自Sigma公司，瓊脂糖購自Takara公司，用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和電泳分析；D—MEM高糖培養(yǎng)液，10％FCS，青霉素購自海科隆公司，用于CHO細(xì)胞的培養(yǎng)；熒光二抗購自cell signaling公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)購自北京中杉金

5、橋公司，用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的免疫熒光檢測。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1.JEV C蛋白編碼基因重組質(zhì)粒構(gòu)建。以日本腦炎病毒SA14—14—2株Total RNA為模板，運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增日本腦炎病毒核心蛋白C基因，并在基因兩側(cè)加入起始密碼子與終止密碼子，然后在基因兩側(cè)加入BamHI/EcoRI酶切位點(diǎn)。反轉(zhuǎn)錄引物：5'GAATTCTTAGGCTC——CTGCACAAGCTATGAC3’，限制性內(nèi)切酶EcoRI(—GAA TTC—

6、)合成至日本腦炎病毒核心蛋白C編碼基因5’末端。PCR法擴(kuò)增前向引物5'GGATCCATGACTAA——AAAACCAGGAGGGC3’，BamHI(—GGA TCC—)合成于5’末端，反向引物為上述反轉(zhuǎn)錄引物。1％瓊脂糖凝膠電泳并回收最終PCR產(chǎn)物，后者與pMD19-T simple連接構(gòu)建重組子pMD—JC。使用PrimeSTAR() HS DNA Polymerase(CodeNo．DRO——10S)，對重組質(zhì)粒pMD—JC以CT

7、B905 F(5'CGGGATCCATGGACTACAAGG——ACGACGATGACAAGATGACTAAAAAACCAGGAGGG3')為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver．2.0(C——ode No． DV805A)進(jìn)行切膠回收約500bp的片段后，使用BamHI/EcoRI進(jìn)行酶切，經(jīng)乙醇沉淀后，命名為Insert DNA；將質(zhì)粒pcDN

8、A3.1(+)使用BamHI/EcoRI進(jìn)行酶切，然后使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver．2.0(Code——No．DV805A)切膠回收約5.4kbp的DNA片段后，命名為Vector DNA；使用Ta——KaRa DNA Ligation Kit(Code No． D6022)中的Solution I將Insert DNA和Vec—-Tor DNA連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coli

9、Competent Cell JM109(Code No． D9052)中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落植菌，提取質(zhì)粒命名為pJC，使用引物BGHrev對上述質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果正確。轉(zhuǎn)化pJC于大腸桿菌DH5α，小劑量提取質(zhì)粒并經(jīng)BamHI/EcoRI酶切電泳鑒定。 2.JEV C蛋白編碼基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pJC轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空載體pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為陰性對照

10、。具體方法為：1.轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天以4×105細(xì)胞/mL接種CHO細(xì)胞于6孔板中(每孔1mL)，37℃，5％CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)24h至轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞達(dá)到90％以上匯合。2.轉(zhuǎn)染：胰酶消化轉(zhuǎn)染用的CHO細(xì)胞，將其接種于6孔板中的蓋玻片，以蓋滿玻片不溢出為度，于37℃，5％CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)24h至轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞達(dá)到90％以上匯合；配制脂質(zhì)體/質(zhì)?；旌衔铮喝芤篈：將重組質(zhì)粒pJC和空載體pcDNA3.1(+)各4μg(每孔)加入D—MEM培養(yǎng)

11、液中，溶液總體積各為250μl(每孔)，輕輕混勻；溶液B：將10μl脂質(zhì)體加入240μlDMEM培養(yǎng)液中，共四管，輕輕混勻，室溫孵育5min；將稀釋的重組質(zhì)粒pJC和空載體pcDNA3.1(+)分別與250μl脂質(zhì)體稀釋液輕輕混勻，室溫孵育20min(這時(shí)溶液會(huì)變渾濁)以形成脂質(zhì)體/質(zhì)粒混合物；用無血清無抗生素的D—MEM培養(yǎng)液洗細(xì)胞3次，轉(zhuǎn)染前的短時(shí)間內(nèi)更換1ml37℃預(yù)溫好的無血清無抗生素的D—MEM培養(yǎng)液；向6孔板中逐滴加入500

12、pl脂質(zhì)體/質(zhì)?；旌衔?，邊加邊搖動(dòng)培養(yǎng)板；在37℃，5％的CO2中培養(yǎng)5—6小時(shí)后用無血清無抗生素的D—MEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，更換含有10％FCS的D—MEM培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)72h；以備下一步做免疫熒光用。 3.免疫熒光檢測。6孔組織培養(yǎng)板培養(yǎng)pJC轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到60％—70％時(shí)，4％多聚甲醛固定細(xì)胞1h，0.1％Triton—100打孔10min，10％BSA封閉1h，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L

13、)4℃過夜孵育，熒光二抗37℃避光孵育1h，50％甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察。 結(jié)果：1、JEV C蛋白編碼基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建。以日本腦炎病毒SA14—14—2株Total RNA為模板，經(jīng)RT-PCR法獲得含有FLAG片段的JEV C蛋白編碼基因重組子pJC，測序分析與發(fā)表的基因序列相符合。經(jīng)酶切鑒定表明：重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI/EcoRI酶切釋出的插入子相對分子量為500bps與pJC經(jīng)相同酶切釋出插入子的分子量大小相一致，

14、應(yīng)用pcDNA3.1 T7噬菌體啟動(dòng)子引物測序分析目的基因在真核表達(dá)載體中正常連接。2、JEV C蛋白編碼基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的免疫熒光檢測。JEV C蛋白編碼基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞可見較顯著綠色熒光標(biāo)記，主要分布在胞漿，少量分布于胞膜。空載體轉(zhuǎn)染或未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中未見特異性綠色熒光標(biāo)記，僅見散在的非特異性綠色熒光雜質(zhì)。 結(jié)論：1、構(gòu)建的重組子pJC含有JEV C蛋白編碼基因。2、轉(zhuǎn)染了JEV C蛋白編碼基