PMG-36e－CD--upp重組質粒的構建及鑒定.pdf

1、目的：為了探討自殺基因在臨床腫瘤治療中的應用，以具有較好靶向性和安全性可以通過重組轉化厭氧菌而特異性表達于腫瘤乏氧區(qū)的表達型載體PMG36e為構建重組質粒的載體，選擇能將原來無毒的前體藥物代謝轉化成細胞毒性產物的自殺基因-大腸桿菌/胞嘧啶脫氨酶/尿嘧啶磷酸核糖轉移酶融合基因(CD::upp)作為目的基因，利用分子生物學相關技術構建PMG36e-CD::upp重組質粒，為轉化入雙歧桿菌及靶向表達于腫瘤乏氧區(qū)并與放療聯合后續(xù)實驗做準備。

2、 方法：用小量制備質粒DNA的方法分別提取表達型質粒載體PMG-36e和自殺基因pORF-CD::upp,取提取的表達型質粒載體PMG-36e進行1％瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收目的條帶后用乙酸鉀沉淀法純化濃縮質粒備用；以質粒pORF-CD::upp為摸板擴增CD::upp基因，設計PCR上下游引物時分別加入限制性內切酶Sac Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位點,PCR反應條件為： 50μl PCR反應體系中含模板DNA10μl，上下游引

3、物各 5μl,Taq 酶 0.5μl，dNTP(2.0mM) 5μl，10xbuffer 5μl,ddH2O19.5μl。反應參數為：94℃預變性5 min后進入循環(huán):94℃變性60s,選擇溫度梯度62-66℃退火120s，72℃延伸60s,35個循環(huán)后；72℃最終延伸20min，擴增出約為1930bp左右特異性目的片段。各取PCR擴增產物10μl以選擇最適退火溫度，確定最佳退火溫度為62.4℃，進行PCR大量擴增后進行1％瓊脂糖凝膠電

4、泳，取分子量為1930bp左右片斷進行膠回收及純化。純化后的表達型質粒載體PMG-36e與自殺基因CD::upp分別用限制性內切酶Sac Ⅰ與SalⅠ進行雙酶切，酶切體系為載體PMG-36e或目的基因CD::upp10μl，限制性內切酶Sac Ⅰ與SalⅠ各1μl，10xbuffer2μl，BSA2μl，ddH2O4μl。酶切體系在37℃進行反應，酶切時間均為4h。終止酶切后取載體PMG-36e 2μl，目的基因coda::upp 3μ

5、l，T4DNA ligase 5μl，16℃恒溫水浴過夜連接。取連接產物5μl進行1％瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。取制備好的感受態(tài)菌100μl加入10μl連接產物(DNA<=50ng)42℃水浴2min進行熱休克后立即冰浴2min，加入LB培養(yǎng)基800μl，37℃，200mm溫和振蕩1h后鋪板(含紅霉素150ug/ml的LB固體培養(yǎng)基)，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，篩選單克隆傳代培養(yǎng)后提取重組質粒鑒定。 結果：PMG-36e-CD:

6、:upp重組質粒用化學法轉化入大腸桿菌JM109后，提取質粒進行1％瓊脂糖凝膠電泳目的條帶，與標準Marker相比較分子量約為5.5Kb，與預計大小一致：取重組質粒PMG-36e-CD::upp 10μl，限制性核酸內切酶Sac Ⅰ與SalⅠ各1μl，10xbuffer 2μl，BSA2μl，ddH2O 4μl。酶切體系在37℃進行反應，酶切時間均為4h，最后65℃ 10min滅活酶。取酶切產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳得到1.9kb(co

7、da::upp)和3.6kb(PMG-36e)片斷，與預計大小一致；以質粒pORF-CD::upp為模板特異性擴增CD::upp基因，PCR反應條件為：50μlPCR反應體系中含模板DNA10μl，上下游引物各5μl，Taq 酶 0.5μl，dNTP(2.0mM)5μl，10xbuffer 5μl，ddH2O 19.5μl。反應參數為：94℃預變性5 min后進入循環(huán)：94℃變性60s，62.4℃退火120s，72℃延伸 60s，35個

8、循環(huán)后；72℃最終延伸20min。擴增出約1.9Kb的CD::upp片段。將PMG-36e-CD::upp重組質粒送上海測序部進行測序鑒定，所用測序儀器為ABI PRISM 3730，測序試劑為BigDye terminator v3.1；通過兩個測序反應得到兩段堿基序列分別為979bp和959bp，分別去除測序引物并且連接后得到1758bp，將此段連接序列用DNAstar軟件分析示與GENEBANK上公布的原序列一致，無開放讀碼框架移