細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)pET30a-EgA31-Eg95重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的：克隆細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)Eg95、EgA31抗原基因，構(gòu)建pET30a-EgA31及pET30a- EgA31-Eg95原核表達(dá)載體，并在大腸埃希菌宿主系統(tǒng)中表達(dá)EgA31及EgA31-Eg95重組蛋白，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡分析。方法：從細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴及成蟲(chóng)組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，分別以原頭蚴cDNA及成蟲(chóng)cDNA為模板RT-PCR克隆獲得Eg95和EgA31抗原基因，將其克隆至pUCm-T載體，測(cè)序確定其正確性。利

2、用定向克隆技術(shù)將EgA31抗原基因片段克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，根據(jù)選擇標(biāo)記的卡那霉素抗性基因篩選到陽(yáng)性克隆，通過(guò)PCR分析和酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)化BL21（DE3），IPTG初步誘導(dǎo)表達(dá)pET30a-EgA31重組蛋白，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，凝膠圖像分析系統(tǒng)確定目的蛋白表達(dá)水平。以測(cè)序正確的pET30a-EgA31重組質(zhì)粒為載體，運(yùn)用酶切連接技術(shù)構(gòu)建pET30a-EgA31 -Eg95重組

3、質(zhì)粒，表達(dá)pET30a-EgA31-Eg95重組蛋白，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，并經(jīng)凝膠圖像分析確定目的蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：測(cè)序表明選取的pET30a-EgA31及pET30a-EgA31-Eg95陽(yáng)性克隆均為正確連接目的基因的重組質(zhì)粒。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組蛋白均得到成功表達(dá)，分別在相對(duì)分子量約為31 kDa及46 kDa處有表達(dá)條帶，表達(dá)量約占菌體總蛋白質(zhì)的26%及20%。結(jié)論：成功克隆并構(gòu)建了pET30a-EgA31及pET30a