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1、細(xì)粒棘球蚴病(Echinococcosis)又稱(chēng)囊性包蟲(chóng)病(cysticechinococcosis,CE),是由處于細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)(續(xù)絳期)寄生于人體或某些動(dòng)物體內(nèi)引起的人畜共患寄生蟲(chóng)病,該病對(duì)人畜危害極為嚴(yán)重。細(xì)粒棘球蚴病呈全球性分布,主要在牧區(qū)、農(nóng)牧區(qū)流行,中國(guó)是該病的高發(fā)區(qū)。細(xì)粒棘球蚴病在我國(guó)的甘肅、新疆、寧夏、內(nèi)蒙古、青海、四川、陜西、西藏等西部、西北部省份尤為嚴(yán)重。該病嚴(yán)重威脅牛、羊等家畜以及人的身體健康,導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性
2、能?chē)?yán)重下降,使我國(guó)畜牧業(yè)每年直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)30多億元,是中國(guó)西部和西北部最嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題之一。目前對(duì)該病的控制主要以犬驅(qū)蟲(chóng)和對(duì)牧民的預(yù)防教育等綜合性防制措施為主,但因種種因素限制,此舉措未獲得理想效果。通過(guò)疫苗預(yù)防將是控制該病的理想途徑之一。現(xiàn)代分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)新技術(shù)的發(fā)展及其在寄生蟲(chóng)病疫苗研究中的應(yīng)用,使棘球蚴病疫苗的研制取得了重大進(jìn)展,基因工程重組抗原疫苗具有極大的應(yīng)用價(jià)值。眾多研究表明,EG95蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的最
3、具保護(hù)作用的抗原,EG95重組基因疫苗也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。
從青海省某屠宰場(chǎng)搜集患細(xì)粒棘球蚴病綿羊,觀(guān)察內(nèi)臟器官病變,取寄生蟲(chóng)包囊及其周?chē)闻K、肺臟組織,進(jìn)行石蠟切片、HE染色,進(jìn)行組織病變觀(guān)察。結(jié)果顯示,細(xì)粒棘球蚴包囊的組織學(xué)結(jié)構(gòu)具有典型的寄生蟲(chóng)肉芽腫特征;內(nèi)側(cè)為紅染的板層狀結(jié)構(gòu);外側(cè)為特殊肉芽層,主要由上皮樣細(xì)胞構(gòu)成,可見(jiàn)多核巨細(xì)胞和少量的淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn);而包囊壁最外層則由成纖維細(xì)胞及膠原纖維組成,其中有
4、大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。包囊的形成對(duì)器官造成的損傷是多方面的,除包囊占位性病變?cè)斐傻慕M織壓迫性萎縮外,并見(jiàn)肝臟間質(zhì)結(jié)締組織及膽管大量增生造成肝硬變,肝臟急性變性、過(guò)敏性炎癥等損傷性反應(yīng)。肺臟可見(jiàn)間質(zhì)增生炎癥及囊液外滲引起的過(guò)敏性炎癥反應(yīng)。
從細(xì)粒棘球蚴病病羊的肝臟以及肺臟分離包囊,抽取囊液,離心取沉淀,分離基因組DNA,用PCR方法擴(kuò)增NADH脫氫酶亞基1(ND1)基因并測(cè)序。通過(guò)GenBank中BLAST分析,結(jié)果顯示所獲ND
5、1序列與細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(G1基因型)ND1序列相似性達(dá)99.9%,確定該地區(qū)流行的細(xì)粒棘球蚴為G1基因型,此法可用于細(xì)粒棘球蚴基因型的快速判定。
取包囊囊液,沉淀原頭蚴,提取總RNA,利用RT-PCR技術(shù)從細(xì)粒棘球蚴中擴(kuò)增了EG95基因cDNA,構(gòu)建了重組克隆載體pGEM-T-EG95cDNA,轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)抗生素篩選獲得重組子并測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EG95基因cDNA序列與Genebank中公布的EG9
6、5基因cDNA序列(AY421719)編碼區(qū)未出現(xiàn)堿基差異,因而編碼的氨基酸未發(fā)生改變。
通過(guò)一系列預(yù)測(cè)分析軟件對(duì)EG95基因以及蛋白的相關(guān)特性及抗原表位加以預(yù)測(cè)分析,同時(shí)根據(jù)分析結(jié)果設(shè)計(jì)引物進(jìn)行信號(hào)肽和疏水區(qū)的切除。分別用全長(zhǎng)的EG95cDNA、切去信號(hào)肽和疏水區(qū)的EG95s構(gòu)建不同的重組表達(dá)載體。在E.coliRosetta(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)了預(yù)期大小的目的蛋白,其中既有以包涵體形式表達(dá)的EG95蛋白也有以可溶形式表
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