哈薩克綿羊MHC包蟲病抗性、非抗性個(gè)體細(xì)粒棘球六鉤蚴侵染期小腸差異表達(dá)基因的分離.pdf

1、棘球蚴病(Echinococcushydatiddisease)即包蟲病(Hydatiddisease)，是制約新疆綿羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要疾病之一，同時(shí)其又是一種人畜共患病，對牧民的身體健康也構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)是由許多緊密連鎖、高度多態(tài)的基因位點(diǎn)組成的染色體上的一個(gè)基因系統(tǒng)，因其高度的多態(tài)性和在抗原遞呈中的重要作用，成為疾病相關(guān)基因研究的熱點(diǎn)之一，已證

2、實(shí)人MHC的多態(tài)性與多種疾病具有相關(guān)性。在綿羊MHC研究方面，本試驗(yàn)室即在前期研究中篩選出了哈薩克綿羊細(xì)粒棘球蚴病抗性、非抗性相關(guān)的MHC基因單倍型，并進(jìn)行了初步的驗(yàn)證。但對此抗性相關(guān)MHC基因單倍型哈薩克綿羊個(gè)體抗包蟲的分子作用機(jī)制尚不知曉。為此，本試驗(yàn)在此前期研究的基礎(chǔ)上，采用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了哈薩克綿羊MHC抗性、非抗性個(gè)體，細(xì)粒棘球六鉤蚴小腸侵染期小腸組織的消減文庫，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行了初步分析，為進(jìn)一步揭示哈薩克綿羊M

3、HC包蟲病抗性相關(guān)基因單倍型個(gè)體抗包蟲的分子作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。結(jié)果如下：
　　1、依據(jù)試驗(yàn)室前期研究中，采用PCR-RFLP技術(shù)獲得哈薩克綿羊細(xì)粒棘球蚴病抗性、非抗性相關(guān)MHC基因單倍型的方法，對250只哈薩克綿羊進(jìn)行了分析，篩選出了細(xì)粒棘球蚴病抗性和非抗性相關(guān)MHC基因單倍型的哈薩克綿羊14只和22只。進(jìn)一步對篩選出來的綿羊個(gè)體進(jìn)行了細(xì)粒棘球蚴抗體的ELISA檢測和肝臟部位的B超探測，選取ELISA檢測結(jié)果為陰性同時(shí)B超探測

4、肝臟部位無包囊的抗性和易感性個(gè)體各3只。以每只綿羊飼喂約5000個(gè)成熟細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵進(jìn)行人工感染，建立了MHC包蟲病抗性、非抗性哈薩克綿羊細(xì)粒棘球蚴六鉤蚴侵染期模型。
　　2、采用抑制性消極雜交技術(shù)建立了MHC包蟲病抗性、非抗性哈薩克綿羊細(xì)粒棘球蚴六鉤蚴侵染期小腸組織的正反向消減文庫。以管家基因GAPDH進(jìn)行了消減效率的檢測，兩個(gè)文庫的消減效率均達(dá)到了25以上，提示所建文庫的質(zhì)量較好，能夠用于后續(xù)的進(jìn)一步分析。
　　采用菌

5、液PCR技術(shù)對正向（抗性相關(guān)組為Tester）和反向（非抗性組為Tester）消減文庫中的陽性克隆進(jìn)行了分析驗(yàn)證，結(jié)果顯示，插入片段大小均在150bp-1000bp之間，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。又分別從正反向文庫中隨機(jī)挑選了57個(gè)和45個(gè)的陽性克?。▎我粭l帶，且大小大于150bp）進(jìn)行了測序分析。分別獲取了單一EST序列43個(gè)和40個(gè)。通過NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast功能對所獲EST序列進(jìn)行了同源性分析。
　　采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對3個(gè)E