犬糞細(xì)粒棘球絳蟲PCR診斷試劑盒的研制.pdf

1、目的：提取細(xì)粒棘球絳蟲感染的犬糞便DNA，建立犬糞細(xì)粒棘球絳蟲巢式PCR診斷方法，對本方法敏感性、特異性及在包蟲病流行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評價(jià)。
　　 方法：收集和豐縣牧區(qū)家犬30只，解剖檢查，收集糞便、成蟲標(biāo)本；實(shí)驗(yàn)室感染細(xì)粒棘球絳蟲犬8只，從感染第1天每天收集糞便標(biāo)本，至41天，犬解剖檢查，收集成蟲標(biāo)本。成蟲和糞便中蟲卵標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；提取成蟲蟲體DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測序鑒定，結(jié)果均為細(xì)粒棘球絳蟲感染，進(jìn)行

2、后續(xù)試驗(yàn)。提取犬糞便DNA，進(jìn)行巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定。建立犬糞細(xì)粒棘球絳蟲PCR診斷方法，對此診斷方法敏感性和特異性進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果：成蟲和糞便中蟲卵標(biāo)本形態(tài)學(xué)鑒定為細(xì)粒棘球絳蟲成蟲和蟲卵；成蟲蟲體DNA擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的片段與設(shè)計(jì)的預(yù)期片段長度一致；測序鑒定，結(jié)果與GenBank中的細(xì)粒棘球絳蟲CO1基因序列AF2976617（G1）比對相似性為99%。犬糞便DNA巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠

3、電泳鑒定，目的片段與設(shè)計(jì)的預(yù)期片段長度一致；測序鑒定，測序結(jié)果與GenBank中的細(xì)粒棘球絳蟲12S核糖體RNA基因AF288824比對相似性為99%。實(shí)驗(yàn)室感染細(xì)粒棘球絳蟲犬糞便DNA PCR擴(kuò)增陽性率為90.34%；最早在感染第17天起，糞便DNA可擴(kuò)出目的片斷；家犬解剖檢查時(shí)檢出細(xì)粒棘球絳蟲的犬，糞便DNA PCR擴(kuò)增陽性率為100%。犬腸道內(nèi)有其他蟲種感染時(shí)不發(fā)生交叉反應(yīng)。感染犬蟲體負(fù)荷量在5~1000條時(shí)用本方法都可擴(kuò)增出目的