LAMP檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲感染犬糞蟲體DNA的研究.pdf

1、目的：為準(zhǔn)確診斷和評(píng)估包蟲病流行區(qū)犬科動(dòng)物細(xì)粒棘球絳蟲感染情況，建立一種快速檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲感染犬糞蟲體 DNA的檢測(cè)方法—環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification. LAMP)。
　　方法：1)針對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲線粒體DNA CO1和ND2基因設(shè)計(jì)2套LAMP引物；分別用兩套引物進(jìn)行LAMP法與普通 PCR方法的特異性比較，檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、犬腸道內(nèi)常見其它寄生

2、蟲(包括犬弓首蛔蟲和泡狀帶絳蟲)以及肥胖帶絳蟲DNA；將含有目的基因片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照，并做10倍梯度稀釋進(jìn)行LAMP法和PCR法敏感性的比較。2)將采集的46份犬糞便標(biāo)本(采集自四川石渠和巴音布魯克草原細(xì)粒棘球絳蟲流行區(qū)以及新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)提取DNA，分別運(yùn)用LAMP、PCR和犬尸體剖檢進(jìn)行3種方法感染犬的初步檢測(cè)評(píng)估。3)運(yùn)用針對(duì)CO1基因設(shè)計(jì)的LAMP引物對(duì)8只人工感染犬進(jìn)行窗口期的初步確定，并與PCR法進(jìn)行比較

3、。
　　結(jié)果：1)成功設(shè)計(jì)兩套LAMP引物，E.gmtDNA CO1基因的引物，以棘球絳蟲DNA(包括細(xì)粒棘球絳蟲絳蟲和多房棘球絳蟲)為模板的反應(yīng)體系出現(xiàn) LAMP陽性結(jié)果，與犬腸道其它寄生蟲和肥胖帶絳蟲為模板的反應(yīng)體系沒有出現(xiàn) LAMP陰性結(jié)果，且該引物的敏感性比普通PCR高出10倍。E.gmtDNA ND2基因的引物能夠鑒別多房棘球絳蟲，并不與其他檢測(cè)的寄生蟲發(fā)生交叉反應(yīng)，且最低檢測(cè)限度為4×101拷貝(靈敏度比普通PCR高出

4、103倍)。2)在初步對(duì)46份犬糞便DNA檢測(cè)結(jié)果中 ND2引物顯示出較好的靈敏度和特異度，χ2檢驗(yàn)，該方法與犬尸體剖檢/PCR方法的診斷效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3) CO1 LAMP引物推定8只人工感染犬的窗口期，LAMP法比PCR法提早2d，與PCR法相比，縮短了E.g感染犬的窗口期。
　　結(jié)論：本研究初步建立了LAMP技術(shù)檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲感染犬的新方法，在各項(xiàng)特異度、靈敏度和樣本檢測(cè)中展現(xiàn)出較好的研究效果。該方法不需要昂貴的儀器設(shè)