hTERT重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達.pdf

1、鄭州大學碩士學位論文hTERT重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達姓名：劉紅梅申請學位級別：碩士專業(yè)：醫(yī)學免疫學指導教師：楊勝利趙國強20040510鄭卅1人學碩士學位論文hTEKT重組質(zhì)粒的構(gòu)矬及批表達陽性克隆并測序。2原核重組質(zhì)粒pGEX4●1hTERT的構(gòu)建：用RTPCR方法擴增出帶有EcoRI酶切位點的hTERT基因片段，hTERT基因片段與pOEM—TEasy克隆載體連接，將重組子轉(zhuǎn)化入JMl09感受態(tài)大腸桿菌中，用藍自篩選，PCR擴增，P

2、Ⅶll酶切鑒定等方法篩選出陽性克隆。用EcoRI酶切pOEM—TEasy—hTERT質(zhì)粒得到目的片段與用EcoRI酶切過的pGEX一4T1質(zhì)粒連接，重組子轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細菌，PCR擴增篩選出陽性克隆?；驕y序并用Omiga20軟件比較分析重組質(zhì)粒中hTERT基因片段與GenBank中公布的已知序列的同源性。二原核重組表達質(zhì)粒的表達鑒定IPTG誘導帶有pGEX4T1hTERT質(zhì)粒的BL21細菌融合蛋白的表達，取不同時間的培養(yǎng)物進行SD

3、SPAGE電泳分析，并進行薄層凝膠光密度掃描測定目的蛋白表達量，同時對表達產(chǎn)物進行Western—blot檢測。結(jié)果：1成功構(gòu)建了pcDNA31hTERT真核重組質(zhì)粒及pGEX4T1hTERT原核重組質(zhì)粒。2經(jīng)過測序表明，hTERT基因片段全長951bp，編碼由317個氨基酸殘基組成、相對分子量為37KDa的蛋白質(zhì)。hTERT基因與GenBank公布的相應基因進行同源性比較，結(jié)果表明核苷酸序列的同源性為9873％，其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列

4、的同源性為9968％。3對SDSPAGE結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，含pGEX一4TIhTERT質(zhì)粒的BL21細菌能夠表達出63KDa的融合蛋白。薄層凝膠光密度掃描測定其表達水平最高為284％，以IPTG誘導4小時表達量最高。4Westernblot檢測表明該融合蛋白可被hTERT多抗識別。結(jié)論：1序列分析結(jié)果證明了所選取的hTERT基因片段是保守區(qū)域，為以hTERT為靶點的腫瘤免疫治療研究提供重要的前提。2成功構(gòu)建了pcDNA31hTERT真核重組