XIAP熒光蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)HeLa細(xì)胞的作用.pdf

1、背景和目的:細(xì)胞凋亡的失衡與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其失衡在不同的腫瘤細(xì)胞中有不同的表現(xiàn)。在目前已知的三條凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路中，凋亡抑制蛋白有著重要作用。因此，凋亡抑制蛋白在惡性腫瘤細(xì)胞中的作用是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。XIAP是凋亡抑制蛋白家族中的一員，它可以通過抑制caspase-3,6,7,9的激活，從而阻斷細(xì)胞凋亡。目前有關(guān)XIAP在宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)中的作用的報(bào)道罕見。本實(shí)驗(yàn)旨在研究： (1)XIAP在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)及作用，

2、(2)HeLa細(xì)胞中由腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)的調(diào)亡與XIAP的作用關(guān)系。以期達(dá)到為宮頸癌的治療提供新靶點(diǎn)。 材料與方法:研究對(duì)象為人宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)。采用：(1)免疫組織化學(xué)染色(S-P法)，觀察XIAP在：HeLa細(xì)胞中的蛋白表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位。(2)通過培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，獲取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)和基因克隆技術(shù)構(gòu)建pEGFP-XIAP和pDsRed2-XIAP融合基因。(3)通過培養(yǎng)HeL

3、a細(xì)胞、細(xì)胞轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡觀察XIAP在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。(4)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、TNF-α干擾(對(duì)照組、空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)等方法，檢測(cè)HeLa細(xì)胞的凋亡情況。 結(jié)果:(1)在HeLa細(xì)胞中存在XIAP蛋白表達(dá)，且陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞漿。(2)培養(yǎng)細(xì)胞MCF-7，采用RT-PCR技術(shù)，獲得了人類XIAP的全長(zhǎng)cDNA(1494bp)。(3)采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建了pEGFP-XIAP和pDsRed2-XIAP融合基因，

4、通過PCR技術(shù)、酶切反應(yīng)，證實(shí)其插入的片段與預(yù)知的相符。其融合蛋白在HeLa細(xì)胞中的定位主要表現(xiàn)為彌漫性地分布在細(xì)胞核和細(xì)胞漿。觀察3天，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)有明顯變化。(4)在轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pDsRed2-XIAP的HeLa細(xì)胞中，加入TNF-α(50ng/ml)，于24t1后收集細(xì)胞，AnnexinV-FITC染色和FCM檢測(cè)，結(jié)果顯示部分HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡，其凋亡率分別為：①未處理的HeLa細(xì)胞為3.92％，②對(duì)照組(只加腫瘤壞死因子

5、TNF-α)45.28％，③空白對(duì)照組(腫瘤壞死因子TNF-α+轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pDsRed2-N1)45.20％，④實(shí)驗(yàn)組(腫瘤壞死因子TNF-α+轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDsRed2-XIAP)11.01％，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組較同等外加條件下細(xì)胞凋亡低(P<0.01)。 結(jié)論:(1)HeLa細(xì)胞中有XIAP蛋白表達(dá)，且其陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞漿。(2)成功地構(gòu)建TpEGFP-XIAP和pDsRed2-XIAP融合表達(dá)質(zhì)粒。其融合蛋白在HeLa細(xì)胞中的定