鉤狀木霉的綠色熒光蛋白標記體系構(gòu)建及其對辣椒的促生和疫霉病害的生防作用.pdf

1、木霉菌（Trichoderma spp.）是一類重要的生防真菌資源，在農(nóng)作物病害的綠色防控中具有重要的發(fā)展前景和應(yīng)用價值。木霉在與宿主植物的互作、促生及生物防治作用的研究將為高效、穩(wěn)定的木霉生防菌制劑的研發(fā)和利用提供重要的理論依據(jù)。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）的綠色熒光蛋白（Green Fluorescence Protein，GFP）基因

2、的轉(zhuǎn)化方法為微生物互作及與宿主植物互作的研究提供了一個強有力的工具。鉤狀木霉（Trichoderma hamatum）ACCC31649是一株優(yōu)秀的生防菌株，前期研究表明該菌株具有顯著促進黃瓜植株生長的特性。本研究通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，建立了生防鉤狀木霉的遺傳轉(zhuǎn)化體系，篩選獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子T.hamatum-GF21。利用熒光顯微技術(shù)揭示了T.hamatum-GF21在辣椒組織及辣椒根際土壤中的定殖能力和特點，并進一步

3、闡明了鉤狀木霉菌株對辣椒植株的促生作用和對辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）生防作用的初步研究。本論文的主要研究結(jié)果如下：
　　1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)鉤狀木霉的轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建及穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子篩選。本研究通過DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）和卡氏白（Calcoflour White）兩種染料對鉤狀木霉ACCC31649的菌絲及分生孢子的細胞核進行組合染色，結(jié)果表明其為單核細胞；優(yōu)化 ATMT轉(zhuǎn)化的乙酰丁香

4、酮濃度、分生孢子懸浮液濃度、誘導(dǎo)培養(yǎng)時間和共培養(yǎng)時間等轉(zhuǎn)化條件；獲得了鉤狀木霉的GFP標記轉(zhuǎn)化子100個，通過連續(xù)繼代的潮霉素抗性篩選和PCR檢測，篩選了10個強綠色熒光和穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。此外，比較了GFP標記轉(zhuǎn)化子與野生型菌株其在形態(tài)學(xué)特征、生長速率、產(chǎn)孢量和生物量等方面的一致性。
　　2、鉤狀木霉菌株在辣椒組織中定殖特點及其對辣椒幼苗的促生作用。通過木霉孢子液灌根接種4葉期辣椒幼苗，標記菌株 T.hamatum-GF21在根

5、際土壤中呈現(xiàn)“先增后降”的數(shù)量變化趨勢；辣椒組織切片的熒光顯微連續(xù)觀察表明，辣椒根、莖和葉組織中都檢測到鉤狀木霉菌株的定殖。30天后，鉤狀木霉處理與水處理相比，辣椒植株的株高增長13.52％，根長增長16.19％，鮮重和干重分別增加了43.75％和45.28％，而且野生型菌株與GFP標記菌株對辣椒的促生作用沒有顯著差異。
　　3、鉤狀木霉對辣椒疫霉菌的生防作用的初步研究。通過平板對峙實驗結(jié)果表明，鉤狀木霉菌株對辣椒疫霉菌生長抑制率