綠色熒光蛋白標(biāo)記的豌豆根瘤菌的獲得與功能分析.pdf

1、共生固氮在生物固氮中占有十分重要的地位。其中，主要的固氮共生體是農(nóng)業(yè)上一類重要作物一豆科植物。根瘤菌(rhizobium)是與豆科植物共生、形成根瘤并固定空氣中的氮素供植物營養(yǎng)的一類桿狀細(xì)菌，這種共生體系具有很強(qiáng)的固氮能力。多數(shù)豆科植物根上形成具有固氮能力的根瘤，這是根瘤菌與豆科植物分子相互作用的結(jié)果。 根瘤菌對宿主豆科植物的侵染有一定的專一性，有的根瘤菌宿主范圍窄，有的宿主范圍廣，根瘤菌進(jìn)入豆科植物的主要方式是在根毛上形成侵入

2、線。在土壤中根瘤菌與豆科植物相互識(shí)別，附著在宿主根毛上，使根毛卷曲，卷曲的根毛將根瘤菌包裹，其細(xì)胞壁內(nèi)陷和伸長，逐漸形成一條管狀的侵入線。侵入線不斷伸長，到達(dá)皮層細(xì)胞，產(chǎn)生分枝，侵入線內(nèi)的根瘤菌不斷繁殖，并釋放到皮層細(xì)胞，使其不斷分裂，形成根瘤組織。根瘤菌在根瘤內(nèi)分化成類菌體，并被宿主來源的膜(又稱類菌體周膜)包圍，類菌體將N2還原成NH3，分泌至根瘤細(xì)胞內(nèi)，并合成酰胺類或酰尿類化合物，輸出根瘤，由根的傳導(dǎo)組織運(yùn)輸至宿主地上部分供利用。

3、但是根瘤菌感染根毛并通過侵入線進(jìn)入根瘤的確切機(jī)制仍不清楚，其中，采用具有熒光標(biāo)記的根瘤菌進(jìn)行相關(guān)研究，將使研究結(jié)果變得具有直觀性，能夠促進(jìn)相關(guān)研究得以更深入地進(jìn)行。 GFP己證明是研究活體系統(tǒng)中的多種生物學(xué)過程的有利工具。自Chalfie等(1994)首次在大腸桿菌中克隆表達(dá)了的GFP以后。GFP作為一種新型的報(bào)告基因迅速引起全世界學(xué)者的極大興趣。GFP作為一種新型的報(bào)告基因具有許多優(yōu)越性：首先它分子量較小，只編碼238個(gè)氨基酸

4、的多肽，對細(xì)胞沒有毒性，不干擾標(biāo)記蛋白的功能和定位。另外，GFP能在異細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并自發(fā)產(chǎn)生熒光的蛋白，由于不需要輔助因子的參與，故可直接用于活體測定。可以說，GFP是當(dāng)前研究活體細(xì)胞中基因表達(dá)和蛋白質(zhì)分布的最好手段之一，具有廣闊的應(yīng)用前景。 本實(shí)驗(yàn)從豌豆根瘤菌gDNA中克隆到用于同源重組的DNA片段，獲得了具有eGFP綠色熒光蛋白標(biāo)記的工程豌豆根瘤菌，以期為今后開展根瘤菌與豆科植物根部或轉(zhuǎn)結(jié)瘤素基因非豆科植物根部的相互識(shí)別、與結(jié)

5、瘤素基因的互作、以及侵入線和根瘤形成等方面的研究奠定基礎(chǔ)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．從豌豆根瘤菌gDNA中克隆到用于同源重組的DNA片段。 進(jìn)一步分析表明，RL—gDNA片段1的序列包含3個(gè)基因。結(jié)構(gòu)表明，3個(gè)基因?qū)儆谕粋€(gè)操縱子單元。其中，陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的編碼區(qū)得到完整克隆，通過序列分析比對，RL—gDNA片段l堿基序列的相似性程度(score)是332位、序列一致性的百分比(identity)為97％、氨基酸性質(zhì)相

6、似比(positives)為98％、比對時(shí)插入的空位比(gaps)為0％，選定該片段作為同源重組片段。 2．構(gòu)建了帶有豌豆根瘤菌gDNA同源重組片段和eGFP基因的原核表達(dá)載體。 3．獲得了具有eGFP綠色熒光蛋白標(biāo)記的工程豌豆根瘤菌成功構(gòu)建了表達(dá)載體pVCT2123，并將其轉(zhuǎn)入豌豆根瘤菌，獲得了GFP標(biāo)記的豌豆根瘤菌。 4．在豌豆上獲得了具有eGFP綠色熒光蛋白標(biāo)記的工程豌豆根瘤菌的根瘤。 利用具有eG