豌豆根瘤菌小RNAs文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、原核生物中的非編碼小RNAs(small RNAs，sRNAs)比人們預(yù)想的要多很多。sRNAs能通過(guò)RNA結(jié)構(gòu)變化、與蛋白質(zhì)結(jié)合、與其它RNAs堿基配對(duì)、與DNA相互作用等機(jī)制參與多方面的生物學(xué)過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、mRNA的穩(wěn)定以及DNA的維持和沉默等。目前相關(guān)的研究主要集中在模式生物大腸桿菌(E. coli)中，并且已經(jīng)確定的sRNAs數(shù)目達(dá)到約80個(gè)。近幾年，人們利用生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)手段，在基因組水平大規(guī)模的尋找sRNAs。這是

2、一項(xiàng)工作量十分巨大、并有廣闊應(yīng)用前景的基礎(chǔ)研究工作。 根瘤菌(Rhizobium， Bradrhizobium， Mesorhizobium， Azorhizoibum，Sinorhizobium)與豆科植物的共生固氮作用是植物與微生物相互作用的代表性模式。目前已開(kāi)始在共生植物中大規(guī)模尋找microRNAs的研究，而在根瘤菌中尋找sRNAs的研究多是建立在生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上，并且尋找區(qū)域也僅限于基因間(intergenic re

3、gions)。 本研究利用Experimental RNomies方法，以豌豆根瘤菌Rhizobium leguminosarum biovar viciae248菌株系為材料，提取根瘤菌三個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期的總RNA，GT法建立其cDNA文庫(kù)。通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，我們共獲得821條有效序列，利用生物軟件數(shù)據(jù)處理后，共獲得418個(gè)contigs。其中約有55個(gè)contigs序列小于13 bp或代表常規(guī)RNAs(tRNAs和rRNAs)。剩

4、余的363個(gè)非常規(guī)RNA contigs經(jīng)nucleotide BLAST操作在Rhizobium leguminosarum biovar viciae strain3841全基因組上定位。由此建立的sRNAs文庫(kù)包括7類(lèi)contigs： 首先是與所有根瘤菌無(wú)匹配序列的“No significant similarity was found”contigs，共有83個(gè)(占所有contigs的22.9％)。其中一部分序列長(zhǎng)度小于

5、20 bp。推測(cè)這類(lèi)contigs的存在主要是248和3841的基因組特別是共生大質(zhì)粒的差別造成的。 其次是三類(lèi)最有可能包含新的sRNAs的contigs，即“Intergenic regions”contigs(69個(gè)，19.O％)、“Antisense within gene”contigs(25個(gè)，6.9％)以及“overlapping reading flames，or overlap of mRNA with inte

6、rgenic region”comigs(34個(gè)，9.4％)。 最后是三類(lèi)代表已知基因ORF的部分片段的contigs，包括“Entire mRNA or mRNA middle part” contigs(95個(gè)，26.2％)、“N-terminal part of mRNA” contigs(30個(gè)，8.3％)和“C-terminal part of mRNA” contigs(27個(gè)，7.5％)。其中“Entire mRN