根瘤菌耐鹽工程菌株的構(gòu)建及其生理特性研究.pdf

1、本論文主要針對(duì)慢生根瘤菌普遍存在耐鹽性差的特點(diǎn)，以及這些資源難以在我國(guó)大面積應(yīng)用的現(xiàn)狀，選擇與兩種主要豆科植物—花生和大豆共生結(jié)瘤良好的花生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.(Arachis)2764)和大豆慢生根瘤菌(BradyrhizobiumjaponicumUSDA110)為材料，運(yùn)用基因工程的手段，將與生物耐鹽相關(guān)的兩個(gè)基因-betH(初步確定編碼甘氨酸甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)及betAB(編碼甘氨酸甜菜堿合成蛋白)分別導(dǎo)入根

2、瘤菌，構(gòu)建耐鹽的根瘤菌工程菌株，并進(jìn)行耐鹽基因表達(dá)及生理特性的相關(guān)測(cè)定分析。論文的主要結(jié)果摘要如下： 1、將編碼甘氨酸甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因betH導(dǎo)入根瘤菌，獲得工程菌354株，其中以質(zhì)粒形式存在的工程菌4株，基因插入到基因組上的工程菌350株。經(jīng)耐鹽性篩選，有2株工程菌(2764/pSZ1.5、110/pSZ1.5)的耐鹽性由80mM提高到120mM，較出發(fā)菌株提高50％。 2、將編碼甘氨酸甜菜堿合成蛋白的基因betA

3、B導(dǎo)入根瘤菌，構(gòu)建以質(zhì)粒形式存在的工程菌2株，經(jīng)耐鹽性篩選，有1株工程菌(2764/betAB)的耐鹽性由80mM提高到120mM，較出發(fā)菌株提高50％。 3、對(duì)轉(zhuǎn)入上述2個(gè)與耐鹽相關(guān)基因表達(dá)的研究結(jié)果表明，工程菌2764/betAB耐鹽性的提高與甜菜堿的含量正相關(guān)，其甜菜堿含量是出發(fā)菌株的3.2倍；而工程菌2764/pSZ1.5、110/pSZ1.5的甜菜堿含量較出發(fā)菌株卻未見(jiàn)明顯變化。進(jìn)一步測(cè)定工程菌2764/pSZ1.5、

4、110/pSZ1.5細(xì)胞內(nèi)游離氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)其中5種氨基酸含量有明顯變化，推測(cè)它們與根瘤菌的耐鹽性相關(guān)。 4、對(duì)耐鹽工程菌進(jìn)行了生長(zhǎng)速度(代時(shí))、耐旱性、穩(wěn)定性和結(jié)瘤能力等生理特性方面的測(cè)定，結(jié)果表明：(1)工程菌與出發(fā)菌株的代時(shí)相差1-2小時(shí)，導(dǎo)入betH和betAB基因可延緩菌的生長(zhǎng)繁殖速度，但變化不明顯；(2)工程菌的耐旱性都略低于或與出發(fā)菌株的耐旱性相當(dāng)，暗示導(dǎo)入基因與耐旱性不直接相關(guān)；(3)整合到基因組上的外源基因可

5、穩(wěn)定存在，2764/pSZ1.5、110/pSZ1.5因基因插入到基因組上，在無(wú)選擇壓力下，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次后基因仍穩(wěn)定存在，而2764/betAB的穩(wěn)定性較差，在無(wú)選擇壓力下，重組質(zhì)粒很容易丟失。(4)蛭石結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)表明，3株耐鹽的根瘤菌工程菌株中2764/pSZ1.5、2764/betAB能夠正常結(jié)瘤，且對(duì)植株的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，尤其是工程菌2764/pSZ1.5。工程菌2764/pSZ1.5、2764/betAB在加入100mMNaC

6、l的情況下仍能夠結(jié)瘤，雖然結(jié)瘤量明顯減少，但出發(fā)菌株在此情況下完全不結(jié)瘤。工程菌110/pSZ1.5在正常鹽濃度及加鹽的情況下，三次重復(fù)都沒(méi)有結(jié)瘤，且對(duì)植株生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3株耐鹽的根瘤菌工程菌株應(yīng)用前景是，110/pSZ1.5對(duì)植株的結(jié)瘤固氮性能及生長(zhǎng)狀況產(chǎn)生抑制作用，不可以應(yīng)用；2764/betAB對(duì)植株的結(jié)瘤固氮性能及生長(zhǎng)狀況沒(méi)有影響，但穩(wěn)定性差，也達(dá)不到應(yīng)用的要求；只有2764/pSZ1.5不僅對(duì)植