高產乳鏈菌肽基因工程菌株的構建及其發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、乳鏈菌肽(Nisin)，是由某些乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L.lactis）在其生長代謝過程中分泌的一種生物多肽類細菌素，具有良好的抑菌效應，對一些食源性腐敗菌或有害菌具有強烈的抑制或殺滅作用。長期以來，該抗菌肽主要作為一種安全高效的天然綠色生物防腐劑普遍用于食品加工企業(yè)。此外，在醫(yī)藥研究（抗生素替代品、生殖避孕、醫(yī)學移植、腫瘤研究）及農業(yè)飼料等領域也極具廣闊的應用前景。
　　而在當前經濟與技術條件下，商品

2、化Nisin的生產主要通過微生物發(fā)酵方法進行，尚存在工業(yè)化產率低，生產成本較高等共性問題。隨著生物防腐劑市場需求的日益增大，合理選育Nisin高產菌株，優(yōu)化其生產菌發(fā)酵性能，提高Nisin工業(yè)生產的發(fā)酵水平，降低發(fā)酵生產成本，已然成為亟需解決的問題。盡管采用傳統(tǒng)誘變、基因組雜交等微生物篩選技術選育Nisin高產菌株已取得一定效果，但這些方法篩選過程復雜繁瑣，工作量較大，獲得高產菌株的效率低，而且所獲得高產菌株往往容易退化，不足以支持長期

3、穩(wěn)定的發(fā)酵應用。近些年來，隨著生物技術的快速發(fā)展與應用，Nisin的生物合成基因簇及其代謝調控途徑已逐漸得以清晰闡明，越來越多的研究人員嘗試基于代謝途徑工程技術來構建高效表達Nisin的基因工程菌株，以期望進一步提高Nisin的工業(yè)化水平。
　　目前Nisin產生菌的代謝工程改造主要通過對影響Nisin生物合成的相關負調控基因進行敲除或改變其合成途徑中特定元件表達水平，或對Nisin的生物合成途徑進行異源表達來提高其發(fā)酵性能。本論

4、文基于對Nisin生物合成途徑中關鍵基因的功能表達及其調控機制的認識，以乳酸乳球菌ATCC11454基因組DNA為模板，利用PCR擴增獲得Nisin生物合成途徑中的關鍵基因nisA（前體基因）ORF和nisRK（調控基因）片段，并通過同源重組技術將nisA ORF和nisRK基因克隆至高拷貝的表達質粒pMG36e中，構建得到重組表達載體pMG36e-nisA和pMG36e-nisA-nisRK。以Nisin產生菌乳酸乳球菌LS01為受體

5、菌，通過電轉化和抗性篩選，獲得過表達nisA的工程菌株LS01/pMG36e-nisA及聯(lián)合過表達nisA和nisRK的工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK。搖瓶發(fā)酵結果顯示，工程菌株LS01/pMG36e-nisA的Nisin效價可達1955 IU/mL，比原始菌株(1472 IU/mL)提高了32.8％;工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK的Nisin效價峰值達到2470IU/mL，比原始菌株提升了6

6、7.8％。生物量測定分析表明，工程菌LS01/pMG36e-nisA和LS01/pMG36e-nisA-nisRK的生長狀況相對于原始菌株也發(fā)生了較明顯的變化，其最大生物量相對于原始菌株均略有降低，且后者下降更明顯。半定量RT-PCR檢測結果表明，目的基因nisA、nisR和nisK在工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK中的轉錄水平均得到了上調，證實了基因nisA、nisR和nisK的過表達對Nisin的生物合成具有顯著

7、促進作用。
　　利用響應面實驗設計對工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化，以進一步提升工程菌株的發(fā)酵性能。結果獲得優(yōu)化后培養(yǎng)基組成為:蔗糖25.06 g/L，玉米漿粉末8.8 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO45 g/L，NaCl2 g/L，MgSO4·7H2O0.3 g/L，CaCO33.5 g/L，Tween-802.7 g/L。搖瓶驗證結果表明，優(yōu)化后工程菌株LS01/pM

8、G36e-nisA-nisRK的Nisin發(fā)酵水平可達到3037IU/mL，比優(yōu)化處理前提升了23％，比原始菌株產量更是提高了106％。利用所得的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基與工程菌株LS01/pMG36e-nisA-nisRK在10L發(fā)酵罐中進行分批補料發(fā)酵研究，結果表明優(yōu)產工程菌株在該發(fā)酵體系中Nisin發(fā)酵效價可達6380IU/mL，比原始生產菌在初始發(fā)酵培養(yǎng)基條件中產量提高了46.2％，較大地發(fā)揮了工程菌株的發(fā)酵潛力。
　　綜上所述，利