Nisin高產(chǎn)菌株Lactococcus lactis N420的基因工程構(gòu)建及其發(fā)酵工藝的優(yōu)化.pdf

1、乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）能夠產(chǎn)生多種對人有利的細菌素。乳酸鏈球菌素（乳鏈菌素，Nisin）是由乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）產(chǎn)生的一種羊毛硫細菌素（Lantibiotics），它可以通過在細胞膜上形成孔道，促使細胞內(nèi)容物滲漏引起細胞凋亡來抑制細菌的生長。由于它的抑菌作用以及進入人體后能夠被迅速酶解成為對人體無害的物質(zhì)，因此是一種高效、天然、綠色的防腐劑。
　　 對于Nisin

2、的理化性質(zhì)以及生物合成基因已有廣泛研究，但在二組分調(diào)節(jié)機制外是否還存在其他調(diào)控基因仍有待研究。此外，隨著國際社會對Nisin需求量的增大，傳統(tǒng)的誘變育種已經(jīng)不能夠滿足日益增加產(chǎn)量的需求。本文通過Mu轉(zhuǎn)座技術(shù)對影響Nisin效價的基因進行研究，在確定基因功能的基礎(chǔ)上，構(gòu)建基因工程高產(chǎn)菌株并進行發(fā)酵生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，進而達到高產(chǎn)的目的。
　　 本文首次利用人工Mu轉(zhuǎn)座技術(shù)對一株NisinZ生產(chǎn)菌株Lactococcus lactisN

3、302中影響其效價的基因展開了研究。首先利用Mu轉(zhuǎn)座插入技術(shù)建立菌株的突變子文庫，然后從約1000個轉(zhuǎn)化子中篩選出一株效價明顯增大的轉(zhuǎn)化子Lactococcus lactis N420進行基因克隆。挑取陽性克隆進行測序，確定了Mu轉(zhuǎn)座片段插入位點。結(jié)果表明菌株Lactococcus lactis N420效價增大是由于Mu轉(zhuǎn)座子單拷貝插入基因choQ造成，已有研究表明choQ基因編碼膽堿ABC復(fù)合體ATP結(jié)合蛋白，具有滲透調(diào)節(jié)和毒性調(diào)節(jié)

4、的功能。本研究首次發(fā)現(xiàn)它可能在Nisin生物合成中具有調(diào)節(jié)作用。
　　 針對Nisin高產(chǎn)突變株Lactococcus lactis N420進行了發(fā)酵工藝優(yōu)化。首先采用單因素實驗及正交實驗等確定菌株發(fā)酵所需要的最佳營養(yǎng)物質(zhì)是酵母粉、復(fù)合氮源、蔗糖和K2HPO4·3H2O，然后采用響應(yīng)面分析法確定營養(yǎng)物質(zhì)的最優(yōu)配比。結(jié)果表明菌株Lactococcus lactis N420的最優(yōu)培養(yǎng)基成分為（w/v）：酵母粉1.50％，復(fù)合氮源