基于工程法構(gòu)建乳糖酶高產(chǎn)菌株及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究.pdf

1、乳糖酶又稱β-半乳糖苷酶，可以催化水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖，并具有半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用。乳糖酶作為一種生物酶制劑，主要用來治療乳糖不耐受癥，處理加工乳制品等，在醫(yī)藥、食品等諸多領域應用十分廣泛。但目前乳糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)還存在許多問題，如:乳糖酶的單位產(chǎn)量較低;多為胞內(nèi)酶，純化工藝復雜，應用成本高;適用范圍較窄，對環(huán)境要求高等。其中米曲霉乳糖酶因其酶學性質(zhì)好、可胞外分泌、商業(yè)化應用多、表達水平低等特點，被本文選為研究對象。
　　本研

2、究首次將米曲霉(Aspergillusoryzae)乳糖酶基因克隆到畢赤酵母表達載體中，實現(xiàn)該乳糖酶的有效分泌和高效表達。以米曲霉cDNA文庫為模板，通過PCR擴增得到米曲霉乳糖酶基因cDNA，序列長度為3015bp。根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性對該乳糖酶基因進行了優(yōu)化，成功提高了其密碼子的使用頻率，去除了不利于轉(zhuǎn)錄和表達的稀有密碼子。然后連入GAP系列的表達載體構(gòu)建基因工程菌株，該系列載體所用的GAP啟動子作為組成型啟動子，不需要其他畢

3、赤酵母工程菌中常用的甲醇誘導步驟，在食品安全上有效避免了因甲醇使用所帶來的問題。經(jīng)過藍白斑初篩及活性測定復篩最終得到了一株高產(chǎn)乳糖酶基因工程菌株GalC131。該菌株可高效地將乳糖酶蛋白分泌到胞外，無需破碎細胞，雜蛋白很少，后續(xù)純化工藝簡單，經(jīng)超濾和凝膠層析后，可直接用于牛奶中乳糖水解。
　　本研究對畢赤酵母工程菌GalC131發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源、金屬離子和pH、溫度、接種量等發(fā)酵條件分別進行了單因素優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基

4、為葡萄糖45g/L、甘油15g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物20g/L、MgSO4·7H2O9g/L、FeSO4·7H2O60mg/L、CuSO4·5H2O6mg/L、K2HPO44g/L、CaSO40.93g/L、K2SO418.2g/L、微量元素液1mL/L，發(fā)酵條件為pH7、30℃、接種量6％，300r/min。搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶酶活可達到672U/mL，較優(yōu)化前提高了30.7％。在1L發(fā)酵罐中對碳源流加速率進行了優(yōu)化，采用15mL

5、/h·L在發(fā)酵16h后開始流加，并將發(fā)酵工藝在50L發(fā)酵罐中成功進行了中試放大，乳糖酶酶活達到4312U/mL，大大高于目前國內(nèi)外報道的乳糖酶產(chǎn)量。
　　本研究對GalC131所產(chǎn)的重組米曲霉乳糖酶進行酶學性質(zhì)研究，并以原始米曲霉乳糖酶作為對照。重組酶的最適pH為5.2，并在pH4.6～8.0之間保持穩(wěn)定;最適反應溫度60℃，熱穩(wěn)定性、金屬離子穩(wěn)定性等都優(yōu)于對照酶，酶學性質(zhì)表現(xiàn)更好。
　　本研究還通過HPLC檢測該乳糖酶在不

6、同條件下對牛奶中乳糖的水解率，初步研究了其在制備低乳糖牛奶中的使用條件。在37℃、3000U/mL酶液0.3％的添加量條件下，乳糖水解率能達94％以上。同時該乳糖酶在低溫條件下也具有良好的乳糖水解率，10℃(0.9％)水解率可達83％以上，25℃(0.9％)可達93％以上，有利于在乳制品生產(chǎn)中避免微生物腐敗，保持牛奶新鮮度，降低生產(chǎn)成本。
　　綜上所述，本研究通過基因工程方法成功開發(fā)了一種產(chǎn)量高、可胞外分泌、后續(xù)純化簡單、生產(chǎn)過程