產(chǎn)乳糖酶酵母菌株的遺傳改良和乳糖酶的發(fā)酵生產(chǎn).pdf

1、馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus)具有代謝底物廣、耐熱性好及比生長速率快等多種優(yōu)良特性，并且能合成大量的乳糖酶、菊粉酶、β-葡萄糖苷酶和其它酶，因而引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。與其它種類的微生物相比，該酵母菌是一類在食品工業(yè)中普遍采用的微生物，用作酶源非常合適。
　　 微生物中普遍存在葡萄糖阻遏現(xiàn)象，當(dāng)有葡萄糖存在時(shí)，許多酶的合成和基因表達(dá)都會(huì)受到抑制。參與葡萄糖阻遏作用的主要為Snfl復(fù)合體和M

2、igl蛋白，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度較高時(shí)，Snfl復(fù)合體去磷酸化，Snfl復(fù)合體失去活性，這時(shí)Migl由于不能被磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核中與受葡萄糖阻遏基因的啟動(dòng)子結(jié)合，使基因表達(dá)受到抑制，說明Migl在菌株的酶合成和調(diào)控中起重要的作用。如果將編碼Migl的MIGl基因敲除，相關(guān)基因的阻遏效應(yīng)解除。因而本研究通過基因敲除法阻斷K.marxianus km菌株MIGl基因，然后研究該基因的敲除對該菌株酶的合成和相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生的影響。首先利用編

3、碼潮霉素的HPT基因的ORF替換km-15菌株的MIGl基因的ORF，在含有潮霉素的YPD平板上篩選獲得了敲除菌株km-15，它能在含有2-脫氧-D-葡萄糖的乳糖培養(yǎng)基平板上生長，而野生型菌株km則都不能，表明敲除菌株葡萄糖阻遏作用解除。與野生型菌株km相比，敲除菌株km-15的乳糖酶、菊粉酶和β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量均有很大提高，同時(shí)編碼這些酶基因的表達(dá)量也有極大提高。這表明，K.marxianus km中的Migl確實(shí)能阻遏某些基因的表

4、達(dá)，對一些酶的合成具有調(diào)控作用。
　　 對敲除菌株km-15產(chǎn)乳糖酶培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳培養(yǎng)基成分為(w/v)：乳清粉10.0％、酵母粉1.5％、蛋白胨1.0％和MnCl21.0 mM。在28℃、pH7.0條件下180 rpm振蕩培養(yǎng)48 h，km-15菌株乳糖酶產(chǎn)量為111.7U/mL。經(jīng)過2-L發(fā)酵罐發(fā)酵，該菌株乳糖酶產(chǎn)量提高到121.7U/mL。同時(shí)，確定了酶法水解乳糖的適宜條件，即乳糖濃度9.0％(w/v)、乳糖

5、酶使用量為440 U/g乳糖、40℃、pH7.0和水解時(shí)間2.5 h，在這種條件下乳糖水解率為99.2％。在同樣條件下，12.0％(w/v)的乳清粉經(jīng)過該酶水解3.5 h后，乳清粉中乳糖水解率為98.7％。調(diào)節(jié)乳糖酶使用量為260 U/g乳糖添加到5.0 mL牛奶中，水解3.0 h后，牛奶中乳糖水解率為99.3％。將上述水解液進(jìn)行薄層層析，結(jié)果顯示水解產(chǎn)物只有單糖，即葡萄糖和半乳糖，其中的乳糖完全水解，表明該乳糖酶在食品工業(yè)中具有潛在的

6、應(yīng)用價(jià)值。
　　 就上面所說的那樣，該酵母菌還產(chǎn)菊粉酶。對敲除菌株km-15產(chǎn)菊粉酶培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳培養(yǎng)基成分為(w/v)：菊粉8.0％、酵母粉3.0％，在28℃、pH4.5的條件下180 rpm振蕩培養(yǎng)42 h，km-15菌株菊粉酶的活力為69.0U/mL。分別以菊粉和菊芋汁作為碳源，經(jīng)過2-L發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵48 h和60 h后，菊粉酶活性分別為79.9 U/mL和73.3 U/mL。然后，確定了酶法水解菊粉的適

7、宜條件，即菊粉濃度6.0％(w/v)、菊粉酶使用量為400 U/g菊粉、50℃、pH4.5、水解時(shí)間3.0 h，菊粉水解率為96.2％。將其水解產(chǎn)物進(jìn)行薄層層析分析，水解終產(chǎn)物以單糖為主，僅有少許寡糖，表明km-15菌株所產(chǎn)菊粉酶為外切菊粉酶。
　　 本實(shí)驗(yàn)室自南極海洋沉積物中分離出1株耐冷酵母Guehomyces pullulans17-1菌株在15℃可同時(shí)產(chǎn)胞外和與細(xì)胞結(jié)合的乳糖酶。故采用NTG對G。pullulans17-

8、1菌株進(jìn)行誘變，結(jié)合X-gal顯藍(lán)斑和發(fā)酵培養(yǎng)測定的選育方法，獲得乳糖酶活力達(dá)24.8u/mL且遺傳穩(wěn)定的突變菌株NTG-133，產(chǎn)量比野生型菌株(13.9U/mL)提高近一倍。對突變菌株NTG-133產(chǎn)乳糖酶培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳培養(yǎng)基成分為(w/v)：乳清粉4.0％、蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％，于15℃、pH4.5條件下，170 rpm振蕩培養(yǎng)132 h，乳糖酶活達(dá)38.0 U/mL。采用發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶，乳糖酶活提高到48