耐熱乳糖酶的分泌表達(dá)研究.pdf

1、乳糖酶（EC.3.2.1.23），或稱β-半乳糖苷酶（Lactase），能水解β-1,4-半乳糖苷鍵。該酶最重要的用途之一是制備低乳糖奶，可以有效地解決乳糖不耐癥的問題，促進(jìn)乳品工業(yè)的迅速發(fā)展。耐熱乳糖酶具有常溫乳糖酶無法比擬的優(yōu)越性，如生產(chǎn)周期短、衛(wèi)生性好、設(shè)備占用率低和能耗低等。由嗜熱脂肪芽胞桿菌（Bacillus stearothermophilus）染色體基因bgaB編碼的乳糖酶具有良好的熱穩(wěn)定性，在70℃仍能保持活性穩(wěn)定。

2、r>　　 對于像耐熱乳糖酶BgaB這種有巨大應(yīng)用潛力的酶，常采用分泌方式將酶分泌到發(fā)酵液上清中，這可以大大簡化分離純化工藝，節(jié)約成本。然而本實(shí)驗(yàn)室先后嘗試了青霉素酰化酶、淀粉酶和中性蛋白酶等信號肽，都未在B.subtilis中對BgaB實(shí)現(xiàn)有效分泌?？赡艿脑蚴怯捎贐gaB中存在特殊結(jié)構(gòu)阻止了成功分泌，因此本課題將研究BgaB結(jié)構(gòu)對蛋白分泌的影響，通過改變BgaB的一級結(jié)構(gòu)來提高該酶的分泌效率。
　　 由于蛋白質(zhì)的表達(dá)是分泌的

3、前提，因此本課題嘗試了LipB、WprA和NprE等多種信號肽來表達(dá)BgaB。得到了重組菌株WB600(pMALipB-bgaB)、WB600(pMAWprA-bgaB)和WB600(pMANprE-bgaB)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各重組菌耐熱乳糖酶BgaB表達(dá)差異非常顯著，其中WB600(pMANprE-bgaB)有較高的表達(dá)，酶活可達(dá)2.091U/mL，WB600(pMAWprA-bgaB)表達(dá)較低，最高酶活僅0.328 U/mL，而WB

4、600(pMALipB-bgaB)無法檢測到乳糖酶活性。這表明信號肽對BgaB的表達(dá)存在較大的影響，有些情況會致使表達(dá)失敗。
　　 為了研究疏水性對BgaB分泌的影響，本論文通過PCR的方法獲得了刪除部分強(qiáng)疏水區(qū)的bgaB-X（X=1、2、3、4、5）基因，構(gòu)建了一系列載體pMANprE-bgaB-X，并將其轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600中，得到了重組菌株WB600（pMANprE-bgaB-X），在此基礎(chǔ)上研究了BgaB中強(qiáng)疏水區(qū)

5、對其分泌的影響。結(jié)果表明，BgaB的 N-端疏水區(qū)的切除能少量提高BgaB的分泌量，而其他強(qiáng)疏水區(qū)的切除不僅對其分泌沒有貢獻(xiàn)，反而降低了BgaB的分泌效率。
　　 此外，本課題還研究了BgaB的長度對其分泌的影響，構(gòu)建了含不同長度的bgaB基因的一系列載體pMANprE-bgaB-Y（Y=A、B、C、D），并將其轉(zhuǎn)入WB600中，得到一系列重組菌WB600(pMANprE-bgaB-Y)。研究結(jié)果顯示，當(dāng)BgaB長度較小時，隨著