黑曲霉D2-26乳糖酶分離純化及酶學性質研究.pdf

1、乳糖酶是一種水解酶，目前主要應用于食品、醫(yī)藥、分析等領域。本研究以酶工程實驗室所保存的一株黑曲霉D2-26為出發(fā)菌株，采用10L發(fā)酵罐發(fā)酵生產乳糖酶，建立了一套簡單易行的乳糖酶提取純化方法并對純酶的酶學性質進行了詳細研究。黑曲霉D2-26乳糖酶是胞外高溫乳糖酶，具有生產成本低、提取純化工藝簡單、穩(wěn)定性好、在生產中可以有效防止雜菌污染等特點，具有廣闊的應用前景。 黑曲霉D2-26乳糖酶經過濾、超濾、硫酸銨分級鹽析、Sephadex

2、G-25脫鹽、DEAE-纖維素-32離子強度梯度層析、SephadexG-100凝膠過濾、DEAE-纖維素-32pH梯度層析等純化工藝分離純化之后，經PAGE電泳鑒定得到單一條帶，達到電泳純。比活力提高到705.91U/mg，比初始發(fā)酵液比活提高了43.7倍多。 純化的黑曲霉D2-26乳糖酶以ONPG為底物時的酶學性質為：最適溫度70℃，作用溫度較廣，在40～70℃都具有較高的酶活性；在30～60℃有較高的耐受性，在30～50℃

3、范圍內處理120min，殘留酶活均在90﹪以上，在60℃下處理相同時間其其殘留酶活為73.42﹪；在4℃冷藏條件下具有良好的穩(wěn)定性，乳糖酶蛋白在低溫貯存20天后酶活才開始降低；最適pH為2.5，作用范圍較寬，在pH2～4.5范圍內均具有較高的酶活性；在pH2～9條件下貯存2d其相對酶活力均在70﹪以上，具有較好的pH耐受性；Mn2+對乳糖酶有顯著激活作用，可使其酶活提高44.94﹪，并且許多金屬離子都能夠在一定程度上提高其酶活性，Hg2

4、+、pb2+對酶活有較強的抑制作用；SDS對酶蛋白的變性作用嚴重抑制其酶活性，半乳糖對黑曲霉D2-26乳糖酶有一定的產物抑制作用，EDTA不影響乳糖酶的活性；以ONPG為底物采用雙倒數作圖法測得Vmax為97nmol/min，Km為8.77mmol/L；SDS-PAGE電泳顯示黑曲霉D2-26乳糖酶分子量116.978KD，為單亞基蛋白；硫酸-苯酚法測得其糖基化程度為11.3﹪。 本論文對乳糖酶的分離純化、酶學性質做了基礎性研究