黑曲霉胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、β-葡萄糖苷酶是纖維素酶中重要的組成成分，能夠?qū)⒗w維二糖水解成葡萄糖。而纖維二糖的積累會(huì)對(duì)內(nèi)切β-葡聚糖苷酶和外切β-葡聚糖苷酶產(chǎn)生明顯的抑制作用，β-葡萄糖苷酶能夠緩解這種抑制作用，所以β-葡萄糖苷酶是纖維素降解過(guò)程中的關(guān)鍵酶、限速酶。但是β-葡萄糖苷酶的水解產(chǎn)物葡萄糖，又會(huì)對(duì)β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生明顯的產(chǎn)物抑制作用。所以發(fā)現(xiàn)一種能夠耐受葡萄糖抑制的β-葡萄糖苷酶是以后的研究方向。
　　黑曲霉在酶制劑方面有著重要的應(yīng)用，有著高效的蛋

2、白分泌系統(tǒng)。黑曲霉也是β-葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株，能夠產(chǎn)生大量的胞外β-葡萄糖苷酶，隨著工業(yè)酶生產(chǎn)菌株CBS513.88和檸檬酸生產(chǎn)菌株ATCC1015測(cè)序工作的完成，我們將預(yù)測(cè)的β-葡萄糖苷酶基因挑選出來(lái)，通過(guò)對(duì)信號(hào)肽的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)黑曲霉含有大量的胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶基因，根據(jù)葡萄糖的運(yùn)輸機(jī)制，推測(cè)胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的耐受葡萄糖的能力可能要優(yōu)于胞外基因。為了驗(yàn)證我們的想法，研究了黑曲霉部分胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)，結(jié)果如下：
　　⑴根

3、據(jù)公布的黑曲霉基因組數(shù)據(jù)顯示，預(yù)測(cè)含有15型β-葡萄糖苷酶，其中3型屬于GH1家族，12型屬于GH3家族。依據(jù)信號(hào)肽的有無(wú)，預(yù)測(cè)含有6型胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶，GH1含有1型，GH3含有5型。
　?、埔喳熎ぁⅪ溄諚U、甘蔗渣（SEB）、纖維二糖、木糖、蔗糖為底物時(shí)，胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的活性存在較大差異，其中能夠誘導(dǎo)出較高活性的底物有麩皮、麥秸桿、甘蔗渣（SEB），而且酶活性隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。以木糖和蔗糖為底物時(shí)，胞內(nèi)β-葡萄糖苷

4、酶的活性很弱。以纖維二糖為底物時(shí)，酶活性不如自然底物時(shí)誘導(dǎo)的明顯，但明顯比木糖的誘導(dǎo)能力突出。
　?、菍?duì)于用以上六種碳源進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，GH1的表達(dá)量始終是最高的，GH3-12的表達(dá)量最低。GH1和GH3-12的表達(dá)模式非常相近，都能夠快速的響應(yīng)麥秸桿，且以纖維二糖為底物時(shí)，表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量降低。其余四種β-葡萄糖苷酶的表達(dá)很相近。
　　⑷在擴(kuò)增GH1家族的基因時(shí)，出現(xiàn)了兩種不同的轉(zhuǎn)化子，其中一個(gè)比正常基因缺失72b

5、p，而且不是隨機(jī)出現(xiàn)的情況，比例約占1/3，通過(guò)同源比對(duì)，這72bp結(jié)構(gòu)為蛋白外層的兩個(gè)α-螺旋之間的連接結(jié)構(gòu)，功能未知。將胞內(nèi)bgl在原核中表達(dá)，可以得到大量表達(dá)，但大部分是以包涵體的形式存在，通過(guò)把誘導(dǎo)物IPTG和降低溫度相結(jié)合的方法，上清中獲得了少量可溶性蛋白，即使有可溶性蛋白，也是沒(méi)有活性的蛋白
　　⑸在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，在上清中不能發(fā)現(xiàn)目的條帶，但是可以測(cè)量到相應(yīng)的酶活，通過(guò)粗酶對(duì)pNPG的活性來(lái)研究胞內(nèi)BG的酶學(xué)

6、性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)最適pH在6.6附近，偏中性，最適溫度在50℃，在55℃時(shí)基本沒(méi)有活性。通過(guò)HPLC對(duì)產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)纖維二糖水解活性最明顯的是GH1-4。GH1-4和GH1-7相比，對(duì)纖維二糖的水解活性下降非常明顯。粗酶液對(duì)纖維二糖反應(yīng)時(shí)沒(méi)有表現(xiàn)出轉(zhuǎn)糖苷的活性。
　　⑹在畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)黑曲霉胞內(nèi)BG，玻璃微珠破碎，經(jīng)過(guò)Ni+初步純化之后，能夠看到微弱的條帶，與分泌表達(dá)相比，酶活大幅度提高。以pNPG為底物時(shí)GH1-4，GH1-7，

7、GH3-12純酶的最適pH在6.6-7.0，pH在4.6時(shí)基本喪失活性，最適溫度都在50℃。胞內(nèi)BG對(duì)pH不敏感，在最適pH的半衰期將近300min，但是胞內(nèi)BG對(duì)溫度比較敏感，而且GH1-7對(duì)溫度非常敏感，半衰期只有60min，其余半衰期210min。以pNPG為底物時(shí)，GH1-4，GH1-7，GH3-12的Km分別為0.277、0.434、0.361mM，對(duì)pNPG的親和性GH1-4要高于GH1-7和GH3-12，葡萄糖對(duì)GH1-4