黑曲霉C112產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等生物質(zhì)原料可經(jīng)加工生產(chǎn)為電力、氣體或液體燃料，具有數(shù)量豐富、可持續(xù)性等優(yōu)點。其中，非糧乙醇的生產(chǎn)和利用在實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展中具有巨大前景。在非糧乙醇的生產(chǎn)過程中，纖維素酶成本約占50％，且纖維素酶粗制品通常酶系組分不全或組分不平衡，需在其中添加一定量的β葡萄糖苷酶(BG)以降低纖維素酶成本。本研究通過對黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶進行一系列的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化，縮短了產(chǎn)酶周期，提升β-葡萄糖苷酶酶活力，促進了非糧乙醇成

2、本的降低。
　　 本文在實驗中為了提升黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶活力，對黑曲霉C112進行接種方式優(yōu)化，并對接種方式改善后的種子培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，確定了以馬鈴薯培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，以發(fā)酵60h后的菌絲體種子液作為接種物進行接種為最佳接種方式?？疾炝藛我蛩貤l件對黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響，包括接種量、碳源、氮源、初始pH值、裝液量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間等，發(fā)現(xiàn)最佳的產(chǎn)酶接種量為6％，較優(yōu)培養(yǎng)基配方為玉米芯56g/L，麥芽浸粉

3、24g/L，硫酸銨2.8g/L，初始pH5。在上述條件下，250mL三角瓶中裝液60mL，28℃、200r/min下培養(yǎng)120h，β-葡萄糖苷酶有最大酶活，為10.566U/ml。較優(yōu)化前的β-葡萄糖苷酶酶活力提高了39.08％。
　　 通過考察不同碳源在不同粒徑下對黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響，獲得了不同碳源及粒徑誘導(dǎo)產(chǎn)酶的最佳條件。分別以未過篩的麩皮，粒徑≤0.180mm的稻草粉，粒徑＞0.180mm的玉米芯為碳源，能達到該

4、碳源條件下的最大誘導(dǎo)產(chǎn)酶能力。其中，適宜粒徑的玉米芯誘導(dǎo)產(chǎn)酶能力最高且成本較低。
　　 采用Box-Behnken中心組合設(shè)計，對黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的條件進行三因素三水平試驗優(yōu)化。對實驗設(shè)計的結(jié)果進行響應(yīng)面分析可知，在優(yōu)化后的產(chǎn)酶條件下，當碳源濃度82.94g/L，產(chǎn)酶溫度30.62℃，初始pH值為6.17時，實際測定的β-葡萄糖苷酶酶活可達31.150U/ml，接近軟件預(yù)測的最大值31.118U/ml。各因素影響β-葡萄糖

5、苷酶酶活力的主次性順序為:碳源濃度＞產(chǎn)酶溫度＞初始pH值。
　　 通過考察發(fā)酵過程中進行pH調(diào)控對黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響，得知在不干預(yù)情況下，培養(yǎng)基pH值通常在一天內(nèi)由6.0降至3.83，最后穩(wěn)定在3.33左右。菌體在第24h到第48h期間新陳代謝活動最為旺盛。由于黑曲霉并未因為發(fā)酵中的pH調(diào)節(jié)使最終產(chǎn)酶能力升高，因此在黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵期間無需進行pH調(diào)節(jié)。
　　 通過考察在發(fā)酵過程中不同階段使用不同發(fā)

6、酵溫度條件對黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響，得知最佳的產(chǎn)酶時間為144h，在發(fā)酵初期設(shè)定溫度30℃，培養(yǎng)36h后，將溫度降低至28℃可以使產(chǎn)酶效果最佳，其酶活值達49.570U/ml。
　　 本文還對β-葡萄糖苷酶的部分特性進行了研究。其中，β-葡萄糖苷酶分解pNPG的Vmax為0.195μmol·.ml-1·min-1，Km為1.249×10-3mol/L。且該酶的最適反應(yīng)溫度為60℃并在該溫度下穩(wěn)定。70℃及70℃以上的溫度環(huán)