黑曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆與表達(dá)研究.pdf

1、β-葡萄糖苷酶(BGL)是一類能夠水解β-1,4-D-糖苷鍵的內(nèi)切水解酶,屬于纖維素酶類,它能夠降解纖維二糖生成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶廣泛存在于各種動(dòng)植物和微生物體內(nèi),具有重要研究?jī)r(jià)值,近年來(lái)通過(guò)對(duì)多種來(lái)源的β-葡萄糖苷酶的研究和開發(fā),這類酶已在醫(yī)藥、食品、飼料、造紙、印染、紡織、石油開采及生物技術(shù)研究等多方面得到了廣泛的應(yīng)用。因此本研究的主要目的是從黑曲霉中獲得β-葡萄糖苷酶基因,并構(gòu)建工程酵母來(lái)高效表達(dá)β-葡萄糖苷酶,以解決目前β-

2、葡萄糖苷酶產(chǎn)量低、成本高等問(wèn)題,同時(shí)也為纖維素高效降解,生產(chǎn)燃料乙醇提供有效的解決途徑。
　　 本研究以黑曲霉Aspergillus niger3.796為材料,依據(jù)其他黑曲霉β-葡萄糖苷酶bg1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,采用RT～PCR方法克隆到β-葡萄糖苷酶基因cDNA全序列。序列分析表明,該cDNA序列全長(zhǎng)2583bp,共編碼860個(gè)氨基酸,該基因已注冊(cè)GenBank,并利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件對(duì)該基因及其編碼蛋白進(jìn)行了分

3、析和預(yù)測(cè)。分析結(jié)果表明該β-葡萄糖苷酶屬于水解酶家族3成員,其氨基酸序列與其它曲霉相比同源性最高可達(dá)96％。
　　 本研究利用畢赤酵母Pichia Pastoris GS115分泌表達(dá)β-葡萄糖苷酶。將β-葡萄糖苷酶基因克隆到分泌表達(dá)載體pPICZaA中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZaA-bgl。經(jīng)過(guò)同源重組,將其整合到畢赤酵母GS115染色體上,重組位點(diǎn)位于AOX1基因啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄終止子之間。利用Zeocin抗性篩選和PCR檢測(cè)獲得