米曲霉FZ58β-葡萄糖苷酶固體發(fā)酵優(yōu)化及酶學(xué)特性的研究.pdf

1、對米曲霉(Aspergillus oryzae)FZ58B-葡萄糖苷酶固體發(fā)酵進(jìn)行優(yōu)化。通過單因素試驗確定最適碳源為甘蔗渣，最適氮源為黃豆餅粉，發(fā)酵初始pH為6.5，固液比為1/3，初步確定固體發(fā)酵的培養(yǎng)基配方。通過Plackett-Burman試驗設(shè)計，考察影響米曲霉固體發(fā)酵8個因素對產(chǎn)酶的影響，篩選到對產(chǎn)酶結(jié)果影響最顯著的3個因素，即麩皮，水和FeSO4。通過Box-Behnken設(shè)計的響應(yīng)面分析法對所篩選到的3個顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，

2、并獲得最佳水平。優(yōu)化后最適的發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)：MgSO40.5，K2HPO41，F(xiàn)eSO40.01，NaNO32，pH6.5，固形物m(麩皮):m(甘蔗渣):m(黃豆餅粉)=4:1.5:0.2，固液比為57:100。發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果：接種量為每5g固形物接種1mL的孢子懸液(濃度為5～7×106個/mL)，發(fā)酵溫度33℃，發(fā)酵時間5天。經(jīng)優(yōu)化，產(chǎn)酶水平從最初的1002.6U/g達(dá)到1401U/g，比優(yōu)化前提高了39.7％，優(yōu)化效

3、果較顯著。 采用硫酸銨分級沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱層析與Sephacryl S-200分子篩柱層析等純化步驟對該酶進(jìn)行了純化，純化后酶的比活力為4125.72U/mg、純化倍數(shù)為7.68、回收率為1.81％。SDS-PAGE電泳測定該蛋白分子量的大小為120.23kDa。 酶學(xué)特性研究表明：最適酶促反應(yīng)溫度為60℃，60℃以內(nèi)酶促反應(yīng)是相對穩(wěn)定的；酶促反應(yīng)最適pH為5.0；酶促反應(yīng)

4、在pH3～9穩(wěn)定。以水楊苷、pNPG為底物分別進(jìn)行酶的動力學(xué)研究，結(jié)果表明，兩者的酶促反應(yīng)都符合米氏方程，最大反應(yīng)初速度Vm分別為0.21mg/mL/min，2500μmol/L/min，米氏常數(shù)Km分別為0.81mg/mL、1mmol/L，活化能(Ea)分別為60.80 kJ/mol、43.54kJ/mol。 金屬離子對酶活力影響研究結(jié)果表明：在終濃度為0-2.5mmol/L時，K+、Li2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+離子