紅曲霉生淀粉酶發(fā)酵優(yōu)化、分離純化及其酶學性質研究.pdf

1、生淀粉酶是指能對不經(jīng)過蒸煮糊化的生淀粉顆粒能夠表現(xiàn)出強水解活性的酶類。由于生淀粉酶能將未經(jīng)蒸煮糊化的生淀粉直接轉化成葡萄糖等可發(fā)酵性糖供微生物生長與代謝，其比傳統(tǒng)的高溫蒸煮糖化節(jié)約25％-30％的能耗。正是由于生淀粉酶具有的潛在的工業(yè)應用價值和某些特殊用途，因此一直受到國內(nèi)外許多研究人員的關注。
　　本課題從生淀粉酶產(chǎn)生菌Monascus M2為出發(fā)菌株，通過發(fā)酵條件和培養(yǎng)基優(yōu)化，使菌株的產(chǎn)酶能力進一步提高，對所產(chǎn)的粗酶液進行了分

2、離純化，并對純化后酶液的部分酶學性質進行了研究。其主要研究結果如下:
　　(1)對紅曲霉M2產(chǎn)生淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵進行了優(yōu)化。對固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化結果表明:溫度為32℃，pH值5.0，無機鹽水量為14mL，培養(yǎng)時間8d時，在該條件下可得到紅曲霉M2產(chǎn)生淀粉酶的最大酶活:445.37U/g。培養(yǎng)基優(yōu)化單因素結果表明:最適碳源為乳糖，氮源為(NH4)2SO4，最適無機鹽為K2HPO4，進一步通過Box-Bohnken中心組成實驗設計和響應

3、面分析，最終確定適宜的培養(yǎng)基條件為:乳糖添加量為1.80g、(NH4)2SO4添加量為1.40g、 K2HPO4添加量為0.2g。預測值為680.29 U/g,在以上優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，對實驗結果進行驗證，得到生淀粉酶酶活為662.21 U/g。
　　(2)紅曲霉M2固態(tài)發(fā)酵成熟曲經(jīng)水浸提、硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose fast flow陰離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析等提純步驟，獲得了比酶活3

4、96.61U/mg蛋白的生淀粉酶、純化倍數(shù)為6.86、回收率為12.70％。其Tricine-SDS-PAGE呈單一條帶。用Tricine-SDS-PAGE測得生淀粉酶的相對分子質量約為67.81kD。
　　(3)對純化后的紅曲霉生淀粉酶進行了酶學性質研究，試驗結果表明:最適作用溫度為50℃，60℃保溫2h仍可以保持近70％的酶活力，最適作用pH為5.0，在pH3.0-7.0的環(huán)境條件下保溫30min仍可以保持60％以上的酶活力。

5、以生玉米淀粉為底物的酶動力學常數(shù)Km和Vmax值分別為14.96mg·ml-1和10.79mg·mL-1·min-1; Mn2+、Ca2+、Ba2+對酶有激活作用，而Na+、K+、Mg2+、Zn2+對酶基本無影響，F(xiàn)e3+對酶有強烈的抑制作用。L-半胱氨酸對該酶有促進作用，SDS、DMSO、DTT和β-巰基乙醇對酶活基本無影響，EDTA和EGTA能較弱抑制該酶的酶活力，而PMSF、KMnO4、氯胺T和Triton X-100則能強烈抑制