紅曲霉生淀粉酶發(fā)酵優(yōu)化、分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、生淀粉酶是指能對(duì)不經(jīng)過(guò)蒸煮糊化的生淀粉顆粒能夠表現(xiàn)出強(qiáng)水解活性的酶類(lèi)。由于生淀粉酶能將未經(jīng)蒸煮糊化的生淀粉直接轉(zhuǎn)化成葡萄糖等可發(fā)酵性糖供微生物生長(zhǎng)與代謝，其比傳統(tǒng)的高溫蒸煮糖化節(jié)約25％-30％的能耗。正是由于生淀粉酶具有的潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和某些特殊用途，因此一直受到國(guó)內(nèi)外許多研究人員的關(guān)注。
　　本課題從生淀粉酶產(chǎn)生菌Monascus M2為出發(fā)菌株，通過(guò)發(fā)酵條件和培養(yǎng)基優(yōu)化，使菌株的產(chǎn)酶能力進(jìn)一步提高，對(duì)所產(chǎn)的粗酶液進(jìn)行了分

2、離純化，并對(duì)純化后酶液的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。其主要研究結(jié)果如下:
　　(1)對(duì)紅曲霉M2產(chǎn)生淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果表明:溫度為32℃，pH值5.0，無(wú)機(jī)鹽水量為14mL，培養(yǎng)時(shí)間8d時(shí)，在該條件下可得到紅曲霉M2產(chǎn)生淀粉酶的最大酶活:445.37U/g。培養(yǎng)基優(yōu)化單因素結(jié)果表明:最適碳源為乳糖，氮源為(NH4)2SO4，最適無(wú)機(jī)鹽為K2HPO4，進(jìn)一步通過(guò)Box-Bohnken中心組成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)

3、面分析，最終確定適宜的培養(yǎng)基條件為:乳糖添加量為1.80g、(NH4)2SO4添加量為1.40g、 K2HPO4添加量為0.2g。預(yù)測(cè)值為680.29 U/g,在以上優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，得到生淀粉酶酶活為662.21 U/g。
　　(2)紅曲霉M2固態(tài)發(fā)酵成熟曲經(jīng)水浸提、硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose fast flow陰離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾層析等提純步驟，獲得了比酶活3

4、96.61U/mg蛋白的生淀粉酶、純化倍數(shù)為6.86、回收率為12.70％。其Tricine-SDS-PAGE呈單一條帶。用Tricine-SDS-PAGE測(cè)得生淀粉酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為67.81kD。
　　(3)對(duì)純化后的紅曲霉生淀粉酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究，試驗(yàn)結(jié)果表明:最適作用溫度為50℃，60℃保溫2h仍可以保持近70％的酶活力，最適作用pH為5.0，在pH3.0-7.0的環(huán)境條件下保溫30min仍可以保持60％以上的酶活力。

5、以生玉米淀粉為底物的酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax值分別為14.96mg·ml-1和10.79mg·mL-1·min-1; Mn2+、Ca2+、Ba2+對(duì)酶有激活作用，而Na+、K+、Mg2+、Zn2+對(duì)酶基本無(wú)影響，F(xiàn)e3+對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用。L-半胱氨酸對(duì)該酶有促進(jìn)作用，SDS、DMSO、DTT和β-巰基乙醇對(duì)酶活基本無(wú)影響，EDTA和EGTA能較弱抑制該酶的酶活力，而PMSF、KMnO4、氯胺T和Triton X-100則能強(qiáng)烈抑制