β-淀粉酶小罐發(fā)酵及酶學(xué)性質(zhì)分析.pdf

1、β-淀粉酶(1，4-α-D-glucan maltohydrolase，EC 3.2.1.2)是一種外切型糖化酶，作用于淀粉時(shí)，能從α-1，4糖苷鍵的非還原性末端順次切下一個(gè)麥芽糖單位，水解直鏈淀粉生成麥芽糖，水解支鏈淀粉生成麥芽糖及大分子的β-界限糊精。由于該酶作用底物時(shí)，發(fā)生沃爾登轉(zhuǎn)位反應(yīng)(Waldeninversion)，使產(chǎn)物由α型變?yōu)棣?型麥芽糖，故名β-淀粉酶。
　　 目前國內(nèi)外的β-淀粉酶主要來源于大麥，從大麥中提

2、取β-淀粉酶工藝復(fù)雜，成本高，耗費(fèi)大量糧食。與植物β-淀粉酶相比，微生物來源的β-淀粉酶具有便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，因此篩選尋找理想的微生物β-淀粉酶源和運(yùn)用生物工程技術(shù)高效表達(dá)β-淀粉酶的基因成為淀粉酶應(yīng)用研究領(lǐng)域中的一個(gè)重要目標(biāo)。
　　 本實(shí)驗(yàn)室用包含來源于枯草芽孢桿菌的P43啟動(dòng)子、來源于短芽孢桿菌的α-乙酰乳酸脫羧酶基因信號肽DNA片段和來源于高溫產(chǎn)硫化氫梭狀芽孢桿菌的β-淀粉酶基因，克隆劍整合質(zhì)粒pMLK83，得到

3、重組質(zhì)粒pMLK83-P43-CTBA。本實(shí)驗(yàn)通過質(zhì)粒pMLK83-P43-CTBA同源重組交換至枯草芽孢桿菌WB600染色體中進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)建整合型重組菌WB600[CTBA]。在不加抗生素控制的LB培養(yǎng)基中，連續(xù)10天(240h)傳代培養(yǎng)，重組菌WB600[CTBA]產(chǎn)β-淀粉酶活力均在241～264U/ml之間，活力比較穩(wěn)定，表明此重組菌可以穩(wěn)定的傳代和表達(dá)。以蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl1％、KH2PO40.03％、MgS

4、O4·7H2O0.3％為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，發(fā)酵pH為7.0，溶氧量為20％～30％為基礎(chǔ)發(fā)酵條件，以培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)基碳源和無機(jī)氮源為研究對象，對重組菌WB600[CTBA]產(chǎn)酶條件進(jìn)行初步研究，研究結(jié)果為：最適發(fā)酵溫度為37℃，最適接種量為1％，最適碳源為1％葡萄糖，最適氮源為0.2％(NH4)3PO4。在最適產(chǎn)酶條件下經(jīng)20L小罐發(fā)酵48h，發(fā)酵液細(xì)胞密度(OD600)最高為29.78，總酶活力為17209U/ml，胞外酶活力為13

5、939U/ml，胞內(nèi)酶活力為3270U/ml，胞外分泌率為81％。同批菌種搖瓶留樣48h的細(xì)胞密度OD600為3.81，產(chǎn)總酶活力為310U/ml，胞外酶活力為202U/ml，胞內(nèi)酶活力為108U/ml，胞外分泌率為65.2％。小罐發(fā)酵細(xì)胞密度是搖瓶的7.2倍，產(chǎn)總酶是搖瓶的55.5倍，產(chǎn)胞外酶是搖瓶的63.4倍，胞外分泌率比搖瓶高13％。優(yōu)化發(fā)酵條件后，發(fā)酵產(chǎn)總酶活力是LB培養(yǎng)基的1.89倍，胞外酶活力是LB培養(yǎng)基的2.48倍。對發(fā)酵