重組SCYL1-BP1基因工程菌株的構(gòu)建及其表達(dá)條件的研究.pdf

1、SCYL1-BP1是本實(shí)驗(yàn)室通過酵母雙雜交技術(shù)，首先從人胎盤cDNA文庫(kù)中克隆得到的一個(gè)能與SCYL1相互作用的新基因。前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白主要分布在核內(nèi)，少量分布于核周和胞漿中。該基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能顯著抑制肝癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)與集落形成，同時(shí)具有顯著抑制荷瘤裸鼠的腫瘤形成的作用。該基因過表達(dá)時(shí)會(huì)延長(zhǎng)細(xì)胞在G2-M期的停留時(shí)間，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。該基因過表達(dá)能穩(wěn)定P53蛋白免于被MDM2介導(dǎo)的泛素化途徑降解?；虮磉_(dá)譜芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)當(dāng)該基因被

2、RNAi抑制時(shí)，可以引起NFκB的表達(dá)上調(diào)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道表明，NFκB的過度激活可以引發(fā)腫瘤。結(jié)果提示，SCYL1-BP1基因具有細(xì)胞周期調(diào)控功能，并具有腫瘤抑制因子的特性。
　　為了獲得足夠量的純化SCYL1-BP1蛋白以便用于進(jìn)行新藥安全性檢測(cè)和一系列藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，我們擬采用基因工程技術(shù)將該蛋白大量表達(dá)。為此本論文分為兩個(gè)部分，第一部分是關(guān)于SCYL1-BP1以大腸桿菌為宿主的原核工程菌株構(gòu)建及后期蛋白鑒定純化，第二部分是關(guān)于S

3、CYL1-BP1在真核畢赤酵母中的克隆構(gòu)建以及后期的蛋白分離鑒定。
　　在論文的第一部分中，我們首先將SCYL1-BP1基因克隆到高效表達(dá)載體pET-28b-sumo上，構(gòu)建了原核表達(dá)重組載體pET-28b-sumo-SCYL1BP1，后轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主菌中，構(gòu)建了原核表達(dá)系統(tǒng)。為了使得重組蛋白SCYL1-BP1大量表達(dá)，我們摸索了宿主菌種的選擇、IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間、接種量等條件的選擇。以期獲得重組蛋白的大量表達(dá)。

4、但經(jīng)過培養(yǎng)條件以及誘導(dǎo)條件的摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白SCYL1-BP1在大腸桿菌這一原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效果欠佳，并不能達(dá)到預(yù)期大量表達(dá)的效果。
　　為此，我們進(jìn)行了重組蛋白SCYL1-BP1的真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。在論文的第二部分中，我們根據(jù)SCYL1-BP1蛋白的氨基酸序列，同時(shí)考慮到畢赤酵母的密碼子偏愛性，設(shè)計(jì)引物，通過重疊PCR的方法，合成了適合在畢赤酵母中表達(dá)的全長(zhǎng)SCYL1-BP1基因序列，并將其克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pHB