生物柴油基因工程菌的構建及釀酒酵母產(chǎn)油脂條件研究.pdf

1、生物柴油是目前研究的熱點，其生產(chǎn)方法是將原料脂肪和甲醇或乙醇在化學催化劑或生物催化劑的催化下，轉化合成生物柴油。目前生物柴油的生產(chǎn)最少需要兩步：油脂的獲得和將油脂轉化為生物柴油。如果能將這兩步集成在同一個生物體系中，將會大大縮短步驟，提高生物柴油的轉化效率。
　　 通過構建生物柴油基因工程菌，將生物柴油專用脂肪酶的基因在酵母中表達，有可能直接把酵母合成的油脂和乙醇在重組體系產(chǎn)生的脂肪酶催化下合成脂肪酸乙酯，從而獲得一種高效的生物

2、柴油生產(chǎn)新技術。
　　 本文克隆了假絲酵母脂肪酶的成熟肽基因Lip2，同時克隆了釀酒酵母的強啟動子PGK1和終止子CYC1，構建了兩個重組表達載體pYES2-Lip2和YEp352-PLC，使得脂肪酶基因在釀酒酵母(Saccharomycescerevsiae)中進行胞內(nèi)表達；同時，本文利用響應面法對釀酒酵母產(chǎn)油脂條件進行了優(yōu)化。
　　 本文對此設想進行了如下主要工作：
　　 1、以假絲酵母(Candida sp

3、.99-125)基因組為模板PCR擴增得到大小為903bp的目的基因片段Lip2，經(jīng)A-T克隆轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性轉化子進行驗證及序列測定，測定結果與報道完全一致；Lip2基因片段經(jīng)過雙酶切處理后插入到pYES2質(zhì)粒中，成功構建了重組表達載體pYES2-Lip2，經(jīng)過半乳糖誘導表達后，由SDS-PAGE鑒定表明，目的蛋白在胞內(nèi)有表達，而在胞外基本沒有表達。但是酶活檢測結果表明，胞內(nèi)目的蛋白基本上沒有活性。
　　 2、以

4、釀酒酵母(Saccharomyces cerevsiae)基因組為模板PCR擴增得到大小為781bp的啟動子基因片段PGK1，以質(zhì)粒pYES2為模板PCR擴增得到大小為260bp的終止子基因片段CYC1，經(jīng)A-T克隆轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性轉化子進行驗證及序列測定，測定結果與報道完全一致；通過重疊PCR法把Lip2基因與CYC1基因融合后，然后把經(jīng)過酶切處理后的PGK1基因和融合基因插入到YEp352質(zhì)粒中，成功構建了重組表達載體

5、YEp352-PLC，由SDS-PAGE鑒定表明，目的蛋白在胞內(nèi)有表達，而在胞外基本沒有表達。酶活檢測結果表明，胞內(nèi)目的蛋白具有1.3U/mL左右的酶活。
　　 3、運用響應面法對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)產(chǎn)油脂以及發(fā)酵條件優(yōu)化進行了研究。首先根據(jù)單因素實驗結果，利用Plackett-Burman設計對影響其產(chǎn)油脂相關因素進行評估并篩選出具有顯著效應的3個因素：檸檬酸，CaCl2和初始pH值。接

6、著用最陡爬坡試驗逼近以上3個因子的最大響應區(qū)域后，采用Box-Behnken設計以及響應面分析法，確定其優(yōu)化后發(fā)酵條件為(w/v)：葡萄糖15％，蛋白胨0.2％，酵母浸粉0.4％，檸檬酸0.471％，MgSO4·7H2O0.1％,ZnSO4·7H2O0.2％,CaCl20.025％，F(xiàn)eSO4·7H2O0.005％，初始pH值為6.74，180 r/min，30℃培養(yǎng)96h。優(yōu)化后的油脂產(chǎn)率(干重)達到14.55％，比在種子培養(yǎng)基中油脂