辣椒疫霉病生防芽孢桿菌快速篩選及菌株B006的代謝活性物質(zhì)研究.pdf

1、本文通過對芽孢桿菌生物膜能力的檢測,生防功能基因的擴(kuò)增,室內(nèi)幼胚感病率法評價其防病效果及溫室防病效果的驗(yàn)證,建立了一種防止辣椒疫霉病生防芽孢菌的快速篩選方法,并對高效菌株菌株B006產(chǎn)生的脂肽類抗生物質(zhì)surfactin進(jìn)行了一系列的研究,具體結(jié)果如下：
　　 ⑴采用聚丙烯酰胺管掛壁方法測定了實(shí)驗(yàn)室保存的93株芽孢菌產(chǎn)生生物膜的能力,獲得48株產(chǎn)生生物膜菌株,采用生防功能基因srfAA、srfAB、ituC和fenD特異引物相對

2、應(yīng)的功能基因進(jìn)行了擴(kuò)增。并以辣椒疫霉為目標(biāo)病原菌,采用幼胚感病率法對上述有生物膜且／或可擴(kuò)增到生防功能基因的菌株進(jìn)行室內(nèi)的防病效果評價,獲得防效50％以上的菌株15株。對其中生物膜產(chǎn)生級別、功能基因和室內(nèi)防效不同的8株菌進(jìn)行溫室防病效果的評價,并對上述結(jié)果進(jìn)行綜合分析,結(jié)果表明生物膜為3級,可擴(kuò)增到基因srfAA、srfAB、fenD,幼胚感病率法篩選中防效較好的菌株,溫室防病效果也較好,防治效果可達(dá)70％以上；生物膜為2級,可擴(kuò)增到s

3、rfAA、srfAB、ituC和fenD基因片段的菌株,幼胚感病率法評價結(jié)果與溫室防病效果基本一致,從而建立了生物膜的檢測,功能基因的擴(kuò)增及幼胚感病率法評價相結(jié)合的生防芽孢桿菌的快速篩選方法,該方法對其他病害生防菌的篩選具有一定的借鑒意義。
　　 ⑵平板拮抗測定表明：溫室實(shí)驗(yàn)中選取的8株芽孢桿菌對辣椒疫霉病菌和黃瓜枯萎病菌均有顯著的抑制作用,但菌株B006的粗提品和發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌的抑制作用明顯好于對辣椒疫霉病菌的抑制作用。

4、HPLC-MS檢測表明,芽孢桿菌B006的粗提品中可以檢測到surfactin和fengycin,其中surfactin含量比較高。通過比較菌株B006在KMB、NA、SWB和Landy培養(yǎng)液中surfactin含量,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液KMB利于surfactin的產(chǎn)生,對芽孢桿菌B006在KMB培養(yǎng)液中不同培養(yǎng)時間的surfactin的HPLC-MS檢測表明,培養(yǎng)72h時surfactin產(chǎn)量最高。
　　 ⑶通過使用固相萃取柱(SPE

5、)對KMB培養(yǎng)液的發(fā)酵液樣品進(jìn)行濃縮和提純,研究了SPE柱不同淋洗條件下對surfactin提取影響,結(jié)果表明淋洗液甲醇與水的體積比為1:1時surfactin的提取效果好于體積比為95:5的提取效果；采用體外添加發(fā)酵液于滅菌土中再提取回收的方法研究了土壤對surfactin吸附作用的影響,發(fā)現(xiàn)土壤的吸附作用對surfactin提取的影響不明顯。對灌根法和基質(zhì)中添加B006菌劑培育辣椒植株,對根上surfactin的HPLC-MS檢測表