防治水稻細(xì)菌性病害生防芽孢桿菌菌株篩選及芽孢桿菌處理后水稻蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、芽孢桿菌(Bacillus spp.)是一種嗜熱、好氧的革蘭氏陽性細(xì)菌，該菌分布廣泛，其能產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)的芽孢、多種抗生素和酶類物質(zhì)，是目前生防細(xì)菌中研究和應(yīng)用較多的一類細(xì)菌。本研究首先通過實(shí)驗(yàn)室和溫室試驗(yàn)，篩選并獲得了對水稻細(xì)菌性病害有較好防治效果的芽孢桿菌生防菌株，同時(shí)通過生防菌株防治水稻細(xì)菌性病害的田間防治試驗(yàn)，綜合評估了芽孢桿菌生防菌株的生防效果。為了解析芽孢桿菌與植物互作的分子機(jī)理，本研究利用蛋白雙向電泳技術(shù)對芽孢桿菌處理后的水

2、稻進(jìn)行蛋白組水平上的差異比較分析，進(jìn)而揭示芽孢桿菌對水稻的促生抗病機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.為了初步篩選用于防治水稻細(xì)菌性病害的芽孢桿菌生防菌株，我們在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行了平板抑菌實(shí)驗(yàn)和水稻促生實(shí)驗(yàn)。室內(nèi)平板抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)室保存的14株芽孢桿菌菌株對水稻白葉枯病菌都有一定的抑菌效果，其中芽孢桿菌菌株90的抑菌效果最好，抑制率達(dá)到了60.87％。芽孢桿菌對水稻促生實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芽孢桿菌處理對水稻有明顯的促生作用，其

3、中芽孢桿菌菌株FZB42對水稻的促生作用最為顯著，水稻幼苗的株高和根長分別增加了40.9％和56.7％，芽孢桿菌菌株90、G1-harpin、38和B3處理對水稻幼苗也有明顯的促生效果，株高分別增加了31.5％、16.2％、10.0％和7.1％;根長分別增加了40.6％、26.4％、15.7％和19.1％。為了進(jìn)一步評估室內(nèi)試驗(yàn)篩選得到的芽孢桿菌菌株的生防效果，我們在溫室條件下進(jìn)行了芽孢桿菌防治水稻白葉枯病實(shí)驗(yàn)。從調(diào)查結(jié)果可知，芽孢桿菌

4、菌株FZB42的防治效果最好，防效達(dá)到52.96％,芽孢桿菌菌株FZB24、90和38的防效也分別達(dá)到了41.01％、36.56％和30.33％。從2008年江蘇省南京市和泗陽市的芽孢桿菌防治水稻白葉枯病田間試驗(yàn)調(diào)查結(jié)果可知，芽孢桿菌在田間自然條件下仍表現(xiàn)出較好的生防效果，芽孢桿菌處理的水稻葉部病情指數(shù)與對照處理相比均存在顯著性差異;芽孢桿菌與化學(xué)農(nóng)藥交替使用能夠顯著提高水稻白葉枯病的田間防治效果。2009年江蘇省泗陽市和湖南省益陽市的

5、芽孢桿菌防治水稻細(xì)菌性條斑病田間結(jié)果顯示，芽孢桿菌不僅對水稻細(xì)菌性條斑病也有較好的生防效果同時(shí)芽孢桿菌處理對水稻還有明顯的增產(chǎn)作用。其中芽孢桿菌菌株B2和B9的田間防效分別達(dá)到了41.56％和36.71％，處理后的水稻產(chǎn)量分別增加了16.22％和14.39％。
　　 2.目前，有許多研究報(bào)道了芽孢桿菌能夠促進(jìn)植物生長和誘導(dǎo)植物抗病性，但芽孢桿菌與植物互作機(jī)制還不是很清楚。本研究旨在利用蛋白雙向電泳技術(shù)對芽孢桿菌處理后的水稻進(jìn)行蛋

6、白組水平上的差異比較分析，進(jìn)而揭示芽孢桿菌對水稻的促生抗病機(jī)制。首先為了建立芽孢桿菌處理后水稻總蛋白高分辨率蛋白雙向電泳體系，本研究對水稻總蛋白提取方法和蛋白雙向電泳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:采用優(yōu)化后的TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白樣品質(zhì)量更高，蛋白樣品的2-DE圖譜清晰，不同等電點(diǎn)和不同分子量的蛋白可以得到很好的呈現(xiàn)與分離。蛋白樣品上樣濃度為0.4mg/mL時(shí)，2-DE圖譜分辨率高、蛋白點(diǎn)分布均勻。等電聚焦過程中低電壓多步除鹽和低

7、電壓聚焦的優(yōu)化方法，可以有效減少等電聚焦過程所產(chǎn)生的橫紋，獲得更加清晰的2-DE圖譜，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明適用于本研究的蛋白電泳聚焦程序?yàn)?50V，1h;500V，1h;800V，1h;1000V，1h;8000V聚焦至60000Vh。
　　 3.芽孢桿菌處理后，水稻根部和葉部中共發(fā)現(xiàn)了31個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)(22個(gè)上調(diào)表達(dá)，9個(gè)下調(diào)表達(dá))。這些差異表達(dá)的蛋白包括了水稻的生長發(fā)育相關(guān)蛋白、抗病防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)蛋白、氨基酸代謝相關(guān)蛋白等。水稻

8、細(xì)胞壁中的木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶在芽孢桿菌處理后明顯的上調(diào)表達(dá)，在水稻生長發(fā)育過程中木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶參與了細(xì)胞壁葡聚糖代謝和細(xì)胞壁的調(diào)節(jié)過程，它的上調(diào)表達(dá)能夠促進(jìn)水稻葉部和莖部伸長從而促進(jìn)水稻生長。芽孢桿菌處理后水稻中的植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)蛋白如:谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，過氧化物酶等也被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，這些蛋白的上調(diào)表達(dá)在蛋白組水平上解釋了芽孢桿菌誘導(dǎo)水稻的抗病機(jī)制。
　　 4.附錄中介紹了研究生在讀期間的另一部分工作，轉(zhuǎn)harpinxooc

9、蛋白編碼基因大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。這部分工作主要是對轉(zhuǎn)harpinxooc蛋白編碼基因大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行探索和優(yōu)化，建立了兩種以胚尖為外植體的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系，即:農(nóng)桿菌介導(dǎo)以胚尖為外植體的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系和基因槍介導(dǎo)以胚尖為外植體的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系。同時(shí)本研究構(gòu)建了植物高表達(dá)載體pCAMBIA3300::hrf2及農(nóng)桿菌菌株EHA105(3300::hr);通過草丁膦抗性篩選獲得了一定數(shù)量的大豆遺傳轉(zhuǎn)化幼苗;大豆轉(zhuǎn)化幼苗