海洋源益生芽孢桿菌的篩選、鑒定及應(yīng)用研究.pdf

1、在水產(chǎn)養(yǎng)殖中由于抗微生物藥物的濫用造成耐藥病原大量出現(xiàn)、養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化、水產(chǎn)品藥物殘留量超標等一系列問題。因而，抗生素替代品的研發(fā)受到了廣泛的關(guān)注。現(xiàn)在，許多關(guān)于益生菌的研究報道表明其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中不僅在一定程度上可以替代抗生素，還可以發(fā)揮許多益生作用，例如，促進魚類生長、提高餌料效率、改善腸道菌群、增強免疫力、拮抗病原及改善水質(zhì)等等。因此，安全、有效的益生菌株的篩選及應(yīng)用對于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。本論文通過體外實驗研究了環(huán)境

2、分離菌株及消化道分離菌株的益生特性（胞外酶產(chǎn)生譜、病原菌拮抗譜）及其對胃腸道內(nèi)環(huán)境的耐受力，同時依據(jù)體外實驗結(jié)果選取分離株Bacillus G024（分離自水體環(huán)境）、Bacillus M001（分離自牙鲆消化道）進行體內(nèi)實驗，研究了其對實驗動物大菱鲆的生長、免疫、抗病力、腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。
　　1.海洋源產(chǎn)胞外酶細菌的分離鑒定
　　本研究從牙鲆（Paralichthys olivaceus）、大菱鲆（S.maximus）

3、、點帶石斑魚(E.coioides)、斑鰷（Konosirus punctatus）消化道及海參露天養(yǎng)殖池的海水和底泥中分離細菌，分別用脫脂乳2216E瓊脂平板（含脫脂乳1％）、馬鈴薯淀粉2216E瓊脂平板（含馬鈴薯淀粉0.3％）、羧甲基纖維素鈉2216E瓊脂平板（含羧甲基纖維素鈉1％）、TW-802216E瓊脂平板（含TW-800.8％）篩選產(chǎn)胞外酶菌株，獲得98株胞外酶產(chǎn)生細菌，其中革蘭氏陽性菌44株、革蘭氏陰性菌54株。進一步對菌

4、落形態(tài)差異較大、產(chǎn)酶譜廣、酶活高的16株細菌進行16S rRNA基因序列鑒定分析，BLAST比對結(jié)果表明上述菌株分別屬于乳酸乳球菌(Lactococcus)(A005)、芽孢桿菌(Bacillus)(B005、G012、G024、K003、M001、N004、P008、Y005)、庫克氏菌(Kocuria)(C005)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)(G002、W003)、弧菌(Vibrio)(H002、P010)、

5、利斯頓氏菌(Listonella)(H012)、殺藻菌(Microbulbifer)(J003)。對上述菌株進行水產(chǎn)常用藥物（呋喃唑酮、四環(huán)素、利福平、氨芐西林、丙氟哌酸、氯霉素）的耐藥性檢測，結(jié)果表明G002、H012、P010都對氨芐西林有不同程度的耐藥性。
　　2.產(chǎn)胞外酶芽孢桿菌對水產(chǎn)病原菌拮抗效果的評價
　　平板擴散法測定產(chǎn)胞外酶芽孢桿菌(Bacillus) B005、G012、G024、K003、M001、N00

6、4、P008、Y005的無菌培養(yǎng)上清抑制12株指示菌（Edwardsiella tarda LSE40、Streptococcus sp.CF、Staphyloccocus aureus、B.cereus、V.anguillarum M3、V.campbellii1.1596、V.fluvialis1.1608、V.harveyi1.1593、V.vulnificus L32、V.parahamolyticus1.1587、V.algi

7、nolyticus1.1607、V.splendidus1.1604）所形成的抑菌直徑;利用掃描電子顯微鏡觀察G024、N004無菌培養(yǎng)上清對指示菌結(jié)構(gòu)的影響。實驗結(jié)果表明除G012、Y005外，其余6株產(chǎn)酶菌株均不同程度的對指示菌產(chǎn)生了拮抗作用;掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果表明G024、N004均對指示菌表層結(jié)構(gòu)發(fā)揮了破壞作用。
　　3.潛在益生芽孢桿菌的生長特性、消化道內(nèi)環(huán)境耐受力及動物安全性研究測試芽孢桿菌B005、G012、G0

8、24、K003、M001、N004、P008、Y005在相對比較寬泛的溫度范圍(10-40℃)、pH值范圍(6-8)、NaCl濃度范圍(0.5-12.5％)內(nèi)均能生長，且多數(shù)菌株的對數(shù)生長期為6h。菌株B005、G012、G024、K003、Y005在相對較高牛膽鹽濃度(0.015％，w/v)下可以生長;同時，菌株G012、G024、K003、M001對人工胃液(0.1％ pepsin、0.9％ NaCl、pH4)具有相對更強的耐受力（

9、3h內(nèi)數(shù)量僅降低2-3數(shù)量級）;此外，菌株B005、G024形成生物被膜能力較強(P＜0.05)。8株測試芽孢桿菌的大菱鲆（S.maximus）血細胞溶血活性皆為陽性、卵磷脂酶活性皆為陰性，不攜帶質(zhì)粒。動物安全性試驗結(jié)果顯示所有菌株對大菱鲆沒有致病性。
　　4.潛在益生芽孢桿菌G024和M001對大菱鲆生長、消化酶活力、天然免疫水平、消化道菌群結(jié)構(gòu)及抗病力的影響
　　潛在益生芽孢桿菌G024、M001與餌料混合，制備成含菌量

10、為5.0×108 CFU/g。進行為期42天的投喂養(yǎng)殖試驗。對實驗魚的體重、特定生長率、餌料系數(shù)進行測定，結(jié)果顯示投喂組和對照組沒有顯著差異(P＞0.05)。對大菱鲆腸道消化酶進行檢測，結(jié)果顯示G024處理組的肝胰臟脂肪酶、胃蛋白酶、胃脂肪酶、胃淀粉酶皆顯著高于對照組(P＜0.05);M001處理組的肝胰臟蛋白酶、肝胰臟脂肪酶顯著高于對照組（P＜0.05）。對血清非特異性免疫學(xué)指標進行檢測，結(jié)果顯示G024處理組血清溶菌酶顯著高于對照組

11、（P＜0.05）;M001處理組超氧化物歧化酶、血清總蛋白含量皆顯著高于對照組(P＜0.05)。但血清一氧化氮合成酶活力、血清酸性磷酸酶活力、血清堿性磷酸酶活力均無顯著變化。用濃度為4.8×104 CFU/mL的致病性鰻弧菌M3（V.anguillarum）以肌肉注射途徑攻毒大菱鲆，結(jié)果顯示投喂細菌組大菱鲆的累計死亡率分別為10.67±2.31％（G024處理組）、33.33±12.86％（M001處理組）皆顯著低于對照組累計死亡率（8

12、9±8.33％）（P＜0.05）。利用PCR-DGGE技術(shù)對腸道菌群樣本進行分析，結(jié)果表明，對照組中的優(yōu)勢條帶I4（Rubritalea spongiae strainYM21-132）、I5(Janibacter anophelis strain CCUG49715)、I6(Uncultured bacterium)、I7(Uncultured bacterium)在處理組中出現(xiàn)不同程度的消失，且對照組的條帶數(shù)量和香濃指數(shù)均高于處理組