乳桿菌的有氧代謝與枯草芽孢桿菌益生作用機(jī)制研究.pdf

1、盡管乳酸菌的分類(lèi)是基于它們厭氧或者微好氧條件下代謝葡萄糖產(chǎn)生乳酸的能力，許多乳酸菌都可以在有氧條件下生長(zhǎng)代謝并利用乳酸。乳酸桿菌（Lactobacillus）屬于典型的乳酸菌，由于其風(fēng)味特性、益生特性、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的能力及發(fā)酵過(guò)程中的易用性，常被用于發(fā)酵食品、青貯飼料和益生菌制劑的生產(chǎn)中。乳酸桿菌在有氧條件下的生理代謝各不相同，如何充分利用有氧生長(zhǎng)獲取高密度的菌體細(xì)胞并通過(guò)降低氧脅迫保持較高的細(xì)胞活性，對(duì)于其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要的

2、意義。
　　 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為一種益生菌廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，在動(dòng)物日糧中添加B.subtilis可以明顯增加胃腸道和糞便中乳桿菌的數(shù)量，但其機(jī)理還沒(méi)有得到充分解釋。
　　 因此，本文以植物乳桿菌(Lb.plantarum)、短小乳桿菌(Lb.brevis)為對(duì)象，對(duì)其有氧代謝進(jìn)行了研究，同時(shí)以B.subtilis168為對(duì)象，基于乳桿菌的有氧代謝對(duì)其益生作用機(jī)制進(jìn)行探討，另外

3、還對(duì)乳桿菌與B.subtilis混合型微生態(tài)制劑的工藝創(chuàng)新進(jìn)行了初步探索，具體結(jié)果如下:
　　 1.Lb.plantarum的發(fā)酵、有氧代謝與氧脅迫
　　 Lb.plantarum是一種廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品、青貯飼料和益生菌制劑的菌株。本文研究了Lb.plantarum LA1在MRS（0.5％葡萄糖）培養(yǎng)基中、以下四種條件下:
　　 ①厭氧條件（靜止培養(yǎng)）;
　　 ②有氧條件（搖動(dòng)培養(yǎng)）;
　　

4、③有氧呼吸條件（搖動(dòng)培養(yǎng)+外源血紅素和維生素K2，即將其電子傳遞鏈補(bǔ)充完整）;
　　 ④過(guò)氧化氫酶保護(hù)條件（搖動(dòng)培養(yǎng)+外源血紅素，即激活其自身過(guò)氧化氫酶）下的代謝特性，包括:
　　 ①生物量(OD600);
　　 ②細(xì)胞活力(CFU/mL);
　　 ③葡萄糖代謝產(chǎn)物（乳酸、乙酸、乙醇）;
　　 ④氧脅迫（培養(yǎng)基中H2O2含量）。
　　 氧氣參與Lb.plantarum LA1的代謝時(shí)對(duì)其具

5、有明顯的兩面性。有氧代謝可使其最高菌體密度從3.5提高至5.0左右，但同時(shí)會(huì)產(chǎn)生高達(dá)3-4 mM的H2O2，因此達(dá)到生長(zhǎng)峰值后細(xì)胞因嚴(yán)重的氧脅迫迅速開(kāi)始死亡，24小時(shí)以后幾乎不能檢測(cè)到活菌。Lb.plantarum發(fā)酵葡萄糖的終產(chǎn)物主要是乳酸，而在有氧條件下轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗岷痛罅恳宜岬幕旌衔?，并且在添加血紅素激活其自身過(guò)氧化氫酶后，高活力細(xì)胞可將乳酸完全轉(zhuǎn)化為乙酸，同時(shí)產(chǎn)生額外ATP而獲得更高生物量。目前關(guān)于Lb.plantarum有氧呼吸的

6、研究并不充分，本文的結(jié)果說(shuō)明，有氧呼吸可以進(jìn)一步促進(jìn)Lb.plantarum的有氧代謝，但對(duì)生物量的提高作用并不明顯，與其它有氧條件并無(wú)顯著差異。
　　 2.Lb.brevis的發(fā)酵與有氧代謝研究
　　 Lb.brevis作為一種重要的發(fā)酵劑，常用于切達(dá)干酪的生產(chǎn)，在干酪的成熟中起著重要作用。本文研究了Lb.brevis ATCC367在上述四種條件下的代謝特性。氧氣參與Lb.brevis的代謝時(shí)對(duì)其具有顯著的益處，既使

7、其生物量從1.5提高至4.1（搖動(dòng)條件）甚至5.5（有氧呼吸），又檢測(cè)不到H2O2的積累，因此可保持較高的細(xì)胞活力。Lb.brevis發(fā)酵葡萄糖的終產(chǎn)物主要是乳酸，同時(shí)伴有CO2和少量乙醇的生成，而在有氧條件下轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗岷痛罅恳宜岬幕旌衔?，并最終將乳酸完全轉(zhuǎn)化為乙酸，同時(shí)產(chǎn)生額外ATP而獲得更高生物量。Lb.brevis的有氧呼吸未見(jiàn)報(bào)道，本文的結(jié)果說(shuō)明，有氧呼吸可以顯著促進(jìn)Lb.brevis的有氧代謝，使其比其他三種條件下具有更迅速的

8、代謝轉(zhuǎn)化和更高的生物量。
　　 3.Lb.brevis有氧代謝時(shí)乳酸向乙酸的轉(zhuǎn)化途徑
　　 在Lb.plantarum和Lb.brevis的有氧代謝中均存在乳酸向乙酸的轉(zhuǎn)化。目前對(duì)Lb.plantarum的這一轉(zhuǎn)化途徑研究比較清楚，即乳酸氧化酶、丙酮酸氧化酶和乙酸激酶途徑，并由丙酮酸氧化酶產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有毒性的H2O2。但Lb.brevis在乙酸生成中并無(wú)H2O2積累，其具體途徑未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)單交換法構(gòu)建了Lb.bre

9、vis ATCC367的丙酮酸脫氫酶缺陷株Lb.brevis ATCC367-pdh和丙酮酸氧化酶缺陷株Lb.brevis ATCC367-pox，其發(fā)酵代謝與野生型并無(wú)明顯差異。但是在有氧代謝時(shí)，丙酮酸脫氫酶缺陷株的生物量較野生型出現(xiàn)大幅下降，終產(chǎn)物中乳酸增加、乙酸減少，且無(wú)乳酸向乙酸的轉(zhuǎn)化。丙酮酸氧化酶缺陷株的有氧代謝與野生型無(wú)異。由此證明了丙酮酸脫氫酶在Lb.brevis有氧代謝中的主導(dǎo)作用。另外，real time RT-PCR

10、顯示，在搖動(dòng)條件下尤其是葡萄糖耗盡時(shí)丙酮酸脫氫酶基因pdh和丙酮酸氧化酶基因pox的表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)，證明了氧氣對(duì)二者的正調(diào)控和葡萄糖對(duì)二者的負(fù)調(diào)控作用。由此，本文闡明了Lb.brevis在有氧代謝時(shí)伴隨額外ATP產(chǎn)生的乳酸乙酸轉(zhuǎn)化途徑，從而為其高密度發(fā)酵和抗氧脅迫提供了理論依據(jù)。
　　 4.B.subtilis協(xié)助乳桿菌對(duì)抗氧脅迫
　　 B.subtilis作為一種益生菌廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其通過(guò)“

11、生物奪氧”機(jī)制為腸道中另一種益生菌——乳酸桿菌創(chuàng)造有利環(huán)境而促進(jìn)其生長(zhǎng)。但是腸道中動(dòng)態(tài)變化的氧氣水平不可避免會(huì)地影響乳桿菌的代謝，且一些乳桿菌可在利用氧氣獲得更高生物量的同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞毒性的H2O2。本文檢測(cè)了B.subtilis在人工腸液中的自裂解現(xiàn)象，并通過(guò)HPLC檢測(cè)驗(yàn)證了其裂解液中含有血紅素。將B.subtilis168與Lb.plantarum LA1進(jìn)行體外搖動(dòng)混合培養(yǎng)2天后，Lb.plantarum的細(xì)胞存活力較單獨(dú)通氧培養(yǎng)

12、提高了109倍;或?qū).subtilis的裂解液添加到培養(yǎng)基中，Lb.plantarum自身過(guò)氧化氫酶被激活，可維持較高細(xì)胞存活力、較高DNA完整度，且培養(yǎng)物中無(wú)H2O2積累。因此，乳桿菌可得益于B.subtilis活菌產(chǎn)生的過(guò)氧化氫酶和裂解后產(chǎn)生的血紅素，從而對(duì)抗氧脅迫。本研究對(duì)B.subtilis現(xiàn)有的益生作用機(jī)理進(jìn)行了進(jìn)一步補(bǔ)充。
　　 5.乳桿菌與B.subtilis混合型微生態(tài)制劑工藝創(chuàng)新初探
　　 液態(tài)混合型

13、微生態(tài)制劑的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是將乳桿菌和B.subtilis分別培養(yǎng)后再混合。一些乳桿菌在通氧培養(yǎng)條件下可獲得更高的生物量，但同時(shí)會(huì)因遭受氧脅迫(如H2O2)而降低細(xì)胞存活力;B.subtilis是一種好氧菌，對(duì)抗氧脅迫的機(jī)制較為完善，它可產(chǎn)生乳桿菌不具有的血紅素和過(guò)氧化氫酶。因此二者的混合培養(yǎng)具有許多優(yōu)勢(shì)。為在終培養(yǎng)物中達(dá)到高菌體蛋白、高乳桿菌活菌數(shù)和高芽孢數(shù)，本文通過(guò)對(duì)接種狀態(tài)、接種量和接種比例進(jìn)行優(yōu)化，確定了在MRS（0.5％葡萄糖）