飼用益生枯草芽孢桿菌的食品安全性評(píng)價(jià)研究.pdf

1、飼用益生菌可以作為添加劑用以促進(jìn)畜禽動(dòng)物健康快速生長(zhǎng)，其中枯草芽孢桿菌以其良好的抗逆性及產(chǎn)酶能力，同時(shí)能夠消耗游離氧以維持腸道厭氧環(huán)境拮抗腸道有害菌群而被廣泛應(yīng)用。飼用益生菌作為活性微生物，需要嚴(yán)格的安全性評(píng)價(jià)，目前主要針對(duì)其潛在感染性、耐藥性等方面展開研究。就飼用枯草芽孢桿菌而言，除了對(duì)其感染性和耐藥性方面進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，對(duì)于其潛在的產(chǎn)蠟樣芽孢桿菌樣毒素的風(fēng)險(xiǎn)也制定了相關(guān)評(píng)價(jià)方法，但是全面開展飼用枯草芽孢桿菌自身代謝物以及其引起畜禽代

2、謝差異在食品安全性方面的研究依然相對(duì)滯后。因此本課題主要通過分離鑒定飼用枯草芽孢桿菌，測(cè)定飼喂枯草芽孢桿菌后對(duì)仔豬血清生化和免疫指標(biāo)的影響，建立熒光定量 PCR方法考察它對(duì)豬腸道主要菌群影響；同時(shí)建立LC/MS-IT-TOF方法，對(duì)枯草芽孢桿菌開展體外代謝研究以及它對(duì)豬消化道和可食性組織中代謝影響的研究，初步獲得益生枯草芽孢桿菌在體外代謝和仔豬體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的差異代謝物信息，為后期對(duì)差異代謝物進(jìn)行定性定量研究和進(jìn)一步借助微生物代謝物

3、組方法對(duì)飼用益生枯草芽孢桿菌代謝物方面開展食品安全性評(píng)價(jià)的研究奠定基礎(chǔ)。
　　1.枯草芽孢桿菌J1220分離鑒定及活性測(cè)定
　　通過常規(guī)生理生化試驗(yàn)和PCR試驗(yàn)鑒定一種飼用益生菌產(chǎn)品中分離的枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis J1220；采用比濁法測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，并確定分離菌株在體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末（24h）能夠產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，對(duì)于金黃色葡萄球菌ATCC29312和大腸桿菌ATCC25922均有抑制作用

4、，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌ATCC29213抑菌性更好；同時(shí)通過微量肉湯稀釋法測(cè)定分離枯草芽孢桿菌J1220對(duì)常見23種抗菌藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌 J1220對(duì)大部分常見抗菌藥均敏感，對(duì)青霉素G和磺胺類藥物耐藥。
　　2.枯草芽孢桿菌J1220對(duì)仔豬血清生化和免疫指標(biāo)及腸道菌群影響研究
　　選擇12頭體重20kg左右的三元雜交去勢(shì)仔豬，建立仔豬回腸瘺管模型，經(jīng)過術(shù)后護(hù)理及停藥期后將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6頭；實(shí)驗(yàn)組仔

5、豬飼喂添加益生枯草芽孢桿菌制劑的基礎(chǔ)日糧，對(duì)照組飼喂不添加益生菌的基礎(chǔ)日糧，在飼喂后的第0d、7d、14d、28d采集血清測(cè)定主要生化和免疫指標(biāo)，結(jié)果顯示在第14d和28d，實(shí)驗(yàn)組血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、肌酸酐（CREA）濃度均顯著增高（P<0.05），同時(shí)血清免疫指標(biāo) IgG、IgM和 IgA濃度也顯著增大（P<0.05），而白蛋白與球蛋白比值則顯著降低（P<0.05）；第0d、3d、7d、10d、14

6、d、28d分別采集兩組動(dòng)物回腸內(nèi)容物和糞便，置于-70℃待檢測(cè)，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)樣品中枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌、腸球菌的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明隨著實(shí)驗(yàn)組飼喂益生枯草芽孢桿菌的時(shí)間增加，腸道及糞便中檢測(cè)的枯草芽孢桿菌數(shù)目也隨著增多，實(shí)驗(yàn)組腸內(nèi)容物和糞便中枯草芽孢桿菌的含量從第7d開始顯著增多（P＜0.01），在14d后時(shí)基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，而對(duì)照組腸道與糞便中枯草芽孢桿菌的含量基本無明顯變化；實(shí)驗(yàn)組腸內(nèi)容物乳酸桿

7、菌和雙歧桿菌的含量從第7d開始顯著增多（P﹤0.05），糞便中乳酸桿菌和雙歧桿菌的含量從第10d開始顯著增多（P﹤0.05）；而腸桿菌和腸球菌的含量從第7d開始實(shí)驗(yàn)組腸內(nèi)容物和糞便均顯著低于對(duì)照組（P﹤0.05）。
　　3.枯草芽孢桿菌J1220體外代謝研究
　　建立枯草芽孢桿菌代謝物組的LC/MS-IT-TOF檢測(cè)方法：首先通過對(duì)比樣品出峰完整性及分離度確定 LC/MS-IT-TOF的液相和質(zhì)譜條件，然后根據(jù)單因素對(duì)照試驗(yàn)

8、和正交試驗(yàn)確立提取溶劑和具體提取方案，考察方法的重復(fù)性后對(duì)試驗(yàn)枯草芽孢桿菌 J1220體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末發(fā)酵上清液中的代謝物提取測(cè)定，比較它與空白肉湯中的代謝物離子信息的差異；同時(shí)建立半體內(nèi)模型考察分離枯草芽孢桿菌與腸道菌群體外共培養(yǎng)情況下差異代謝物離子信息情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相選擇A相：0.1％甲酸-水（V/V），B相：乙腈，采用梯度洗脫條件能夠使離子峰出峰完全且分離良好；通過單因素對(duì)照試驗(yàn)確定了以體積比為1:1的乙酸乙酯和二氯甲烷混

9、合溶劑，渦旋5min液液萃取的提取方法，方法重復(fù)性考察發(fā)現(xiàn)批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)小于15%，符合試驗(yàn)要求；試驗(yàn)在枯草芽孢桿菌 J1220體外培養(yǎng)發(fā)酵上清液與空白肉湯中發(fā)現(xiàn)15種差異代謝物離子信息，分別是 m/z470.2441、474.9189、221.1185、277.1827、316.6631、340.1951、472.8264、453.2828、431.2678、409.2591、443.3213、501.8521、479.8

10、179、460.2983、438.2803；同時(shí)建立半體內(nèi)模型發(fā)現(xiàn)，與體外純培養(yǎng)相比，當(dāng)枯草芽孢桿菌 J1220與腸道菌群共培養(yǎng)時(shí)，m/z277.1827、340.1951、472.8264、431.2678、409.2591、443.3213、501.8521、479.8179、460.2983、438.2803、416.2708等代謝物信息完全檢測(cè)不到，說明在腸道復(fù)雜條件下可能存在的差異代謝物與體外純培養(yǎng)情況不一致，因此建立動(dòng)物試驗(yàn)

11、模型進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　4.枯草芽孢桿菌J1220對(duì)仔豬代謝影響研究
　　根據(jù)體外試驗(yàn)篩選的提取溶劑建立空白腸液、血漿和9種可食性組織樣品前處理方法，并進(jìn)行方法重復(fù)性考察；通過建立的仔豬回腸瘺管模型在實(shí)驗(yàn)組飼喂枯草芽孢桿菌J1220制劑后的第0d、3d、7d、10d、14d、28d分別采集兩組動(dòng)物回腸內(nèi)容物和血漿，同時(shí)在第28d宰殺動(dòng)物并采集肝臟、腎臟、肌肉、脂肪、心臟、肺臟、胃、小腸和大腸等可食性組織；采用建立的腸液、血漿及

12、可食性組織樣品前處理方法對(duì)動(dòng)物試驗(yàn)樣品樣品處理，經(jīng)過LC/MS-IT-TOF檢測(cè)后以體外純培養(yǎng)獲得的15種代謝物離子信息為靶標(biāo)提取離子流，考察枯草芽孢桿菌J1220對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物代謝影響。結(jié)果顯示，建立的腸液、血漿和組織樣品代謝物提取和檢測(cè)方法重復(fù)性良好，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%；檢測(cè)仔豬回腸瘺管模型采集的腸液、血漿及可食性組織樣品發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腸液及血漿中的差異代謝物離子信息分別為 m/z470.2441和m/z474.9189

13、，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腸液第3d開始出現(xiàn)差異離子信息，血漿第7d開始出現(xiàn)差異離子信息；而實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組第28d組織樣品中僅肝臟、腎臟、小腸、大腸中有明顯的差異，肌肉和胃中離子信息響應(yīng)相對(duì)較低，脂肪、心臟、肺臟中未提取到差異離子信息。
　　綜上所述，本課題分離并鑒定了益生枯草芽孢桿菌J1220，測(cè)定了其對(duì)于23種抗菌藥敏感性以及抑菌活性；建立仔豬回腸瘺管模型現(xiàn)飼喂 J1220益生菌制劑能夠顯著提高仔豬腸道有益菌群數(shù)量而抑制有害菌群數(shù)量，同時(shí)經(jīng)