豬源益生芽孢桿菌的分離篩選與應(yīng)用研究.pdf

1、因抗生素濫用而導(dǎo)致的毒性殘留、耐藥性等問題已引起人們的廣泛關(guān)注。尋找安全、無毒的替代品迫在眉睫。長期的生產(chǎn)實踐及大量研究表明，多種芽孢桿菌對動物正常生理狀態(tài)的維持和生長繁殖都有重要意義。芽孢桿菌不僅有抑制常見病原菌生長的能力，還能產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)，是益生菌菌種開發(fā)的重要來源。
　　 本研究依據(jù)益生菌篩選的常規(guī)方法和芽孢桿菌的判定標準，分離得到一株具有優(yōu)良益生特性的地衣芽孢桿菌B36，研究了其體外益生性能、應(yīng)用特點和優(yōu)化了發(fā)酵生產(chǎn)

2、工藝，斷奶仔豬飼喂實驗驗證了其防病促長效果。具體研究結(jié)果如下：
　　 1、從健康育肥豬糞便中分離到160株芽孢桿菌，其中菌株B36對家畜養(yǎng)殖業(yè)中常見的腸道病原微生物如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0139和腸炎沙門氏菌具有有明顯的拮抗能力。經(jīng)過生理生化實驗和16S rDNA序列分析鑒定為地衣芽孢桿菌，進一步研究表明該菌株具有較強的耐受人工胃液、人工腸液和耐膽汁的能力，能夠在動物腸道中發(fā)揮作用。該菌株芽孢具有一定的耐熱性，處理溫度低于8

3、0℃時，芽孢存活率保持100％，但100℃處理15 min后，存活率為5.5％。
　　 菌株B36對常用的多種抗生素要具有很高的敏感性，在供試的24種抗生素中，只有多粘菌素B和桿菌肽對B36的抑制效果較弱，表明菌株不含有耐藥性質(zhì)粒，不會在動物腸道中的微生物之間造成抗生素抗性的水平轉(zhuǎn)移。
　　 2、通過對菌株抗菌物質(zhì)的純化和理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌B36產(chǎn)生小分子的蛋白質(zhì)類細菌素，表現(xiàn)出廣譜抗菌作用，對革蘭氏陽性細菌

4、都表現(xiàn)出強烈的抗菌活性，對部分革蘭氏陰性細菌也表現(xiàn)出抗菌能力，而對酵母和霉菌等真核微生物沒有抑制。細菌素具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，100℃處理30 min對活性沒有影響，115℃處理30 min活性損失75％，121℃處理30 min活性全部喪失；在pH4-10的范圍內(nèi)活性沒有變化。經(jīng)過有機溶劑處理后的細菌素活性沒有損失。細菌素對常見蛋白酶也有抗性，僅對蛋白酶K敏感，作用1 h后活性下降到25％。經(jīng)過硫酸銨沉淀和葡聚糖凝膠Supe

5、rdexTM G-75層析純化，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示細菌素的分子量為1422 Da。
　　 3、通過單因素實驗和正交設(shè)計得到地衣芽孢桿菌B36的固體發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基為麩皮700 g，稻草粉300 g，添加葡萄糖40 g/kg，蛋白胨20 g/kg，酵母抽提物20 g/kg，KH2PO410 g/kg，生石灰5 g/kg，調(diào)節(jié)初始含水量65％，37℃靜置發(fā)酵48 h芽孢產(chǎn)量可以達到1.73×1011 CFU/g。
　　 采用上述

6、優(yōu)化條件，一種簡單實用、新型的網(wǎng)袋式生物反應(yīng)器（φ120×800 mm）被用于地衣芽孢桿菌固體發(fā)酵中試生產(chǎn)，芽孢產(chǎn)量可達到1.2×1011CFU/g，同淺盤式生物反應(yīng)器相比節(jié)約培養(yǎng)空間，具有更高的生產(chǎn)效率。
　　 4、應(yīng)用Plackett-Burman實驗設(shè)計，對影響地衣芽孢桿菌B36液體發(fā)酵產(chǎn)生芽孢的諸多因子進行了評價，篩選出了影響發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽的主要內(nèi)在因素。在Plackett-Burman實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)曲面法對主要影

7、響因子進行優(yōu)化與評價，并能得到影響地衣芽孢桿菌B36發(fā)酵產(chǎn)芽孢的二次多項數(shù)學模型，并利用統(tǒng)計學方法對該模型進行了顯著性檢驗。通過對該模型進行求導(dǎo)和解逆矩陣可知，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：玉米淀粉46.6 g/L，蛋白胨3.8 g/L，豆粕粉21.3 g/L，（NH4）2SO41.9g/L和CaCO3·2.4 g/L，相應(yīng)的芽孢產(chǎn)量預(yù)測值為Y=8.9×109 CFU/mL。采用優(yōu)化的培養(yǎng)基進行驗證試驗，地衣芽孢桿菌最終芽孢濃度可以達到9×10