枯草芽孢桿菌芽孢表面展示人血清白蛋白及芽孢的蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、人血清白蛋白(human serum albumin,HAS)是血液中最重要的載體蛋白和血漿蛋白成份,具有非常重要的生理功能。在臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐中,HAS被廣泛的用來治療低血容量,慢性腎炎、肝炎和晚期惡性腫瘤等各種重癥病人。目前臨床上使用的HAS主要是靠收集人的血液通過分級(jí)過濾獲得,但是人血漿來源有限,價(jià)格昂貴,并且來源復(fù)雜,容易導(dǎo)致血源性污染,如肝炎病毒,艾滋病毒等。
　　 枯草芽孢桿菌是一種非致病性的革蘭氏陽性菌,在營養(yǎng)缺乏或其

2、它脅迫的條件下能形成具有抗逆性的休眠體——芽孢。由于芽孢具有獨(dú)特的抗逆性,在極端的溫度、輻射和毒性化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境下也能長期存活。因此,芽孢成為在極端環(huán)境中運(yùn)載外源蛋白或具有活性的生物大分子的有效載體。本研究的目的是通過芽孢表面展示技術(shù)將}tSA展示在芽孢表面,構(gòu)建具有營養(yǎng)功能的表面展示有HAS的重組芽孢。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 (1)提取人體組織的總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增出人血清白蛋白基因has的編碼序列,并

3、進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)庫比對(duì)鑒定。
　　 (2)將has克隆到質(zhì)粒pJS700上,使has與芽孢衣殼蛋白基因cotC融合,構(gòu)建融合表達(dá)CotC-HSA的整合型重組質(zhì)粒pJS700-HSA。
　　 (3)用質(zhì)粒pJS700-HSA轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞,篩選得到重組菌株并誘導(dǎo)該菌株產(chǎn)生芽孢,用Westernblot和免疫熒光檢測(cè)HSA成功的展示在芽孢表面。
　　 (4)用表面展示HSA的重組芽孢口服接種小鼠,持續(xù)灌胃3

4、0天,摘眼球取血分析口服重組芽孢對(duì)小鼠血清白蛋白含量的影響。結(jié)果表明口服芽孢不會(huì)給小鼠胃腸道帶來不適,并且口服大劑量重組芽孢可以有效增加小鼠血清中白蛋白的含量。
　　 (5)用二維電泳和質(zhì)譜鑒定技術(shù)對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析。二維電泳后總共獲得158個(gè)蛋白點(diǎn),用質(zhì)譜成功鑒定出71個(gè)蛋白,之后對(duì)鑒定的蛋白進(jìn)行功能分類和親水性分析。
　　 (6)對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌的芽孢蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,研究