10747.枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體和表面展示載體的構(gòu)建

1、分類號(hào)：Q墨15密級(jí)：公玨單位代碼：iQQ豎學(xué)號(hào)：2Q!l!!壘枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體和表面展示載體的構(gòu)建ConstructionoftwoexpressionshuttlevectorsandasurfacedisplayvectorforBacillussubtilis學(xué)位申請(qǐng)人：李志輝指導(dǎo)教師：檀建新教授學(xué)科專業(yè)：發(fā)酵工程學(xué)位類別：工學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一四年六月一日摘要枯草芽孢桿菌(Bacillussub

2、tilis)是一種極具潛力的外源蛋白表達(dá)宿主菌，不論是用來(lái)高效表達(dá)外源蛋白還是作為口服疫苗或全細(xì)胞酶的載體，都展現(xiàn)出其他細(xì)菌無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，是研究較多、應(yīng)用廣泛的生物安全菌。質(zhì)粒是外源蛋白異源表達(dá)的必須工具，目前，可用于外源蛋白在丑subtilis中表達(dá)的質(zhì)粒雖然不少，但遺傳操作方便、表達(dá)效率高的Ecoli—Bsubtilis穿梭表達(dá)載體和能直接將外源蛋白展示在芽孢表面的穿梭表達(dá)載體仍然缺乏。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了兩個(gè)穿梭表達(dá)載體和一個(gè)表面展示的

3、載體，用4種報(bào)告基因進(jìn)行了驗(yàn)證，主要內(nèi)容如下：1通過融合PCR將來(lái)源于Asubtilis的木糖啟動(dòng)子(PxylR)序列和來(lái)源于大腸桿菌(Escherichiacold表達(dá)載體pET21b的T7肽和多克隆位點(diǎn)區(qū)等序列融合替換了Ecoli丑subtilis穿梭載體pHT315的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建了一個(gè)能由D木糖誘導(dǎo)表達(dá)的EcoliBsubtilis穿梭表達(dá)載體pTL。PCR擴(kuò)增得到了綠色熒光蛋白(GFP)基因咖，B葡萄糖苷酸酶(GUS)基因g

4、us，人淀粉樣前體蛋白(APPsw)基因彳PP刪和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)脂肪酶基因lipa，并分別插入pTL的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建了重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BsubtilisWB800，獲得了工程菌WB800一gfp、WB800一gus、WB800一APPsw和WB800一lipa。熒光顯微鏡下可以觀察到WB800gfp菌體發(fā)出綠色熒光，表明GFP成功表達(dá)，用熒光分光光度法確定了檢測(cè)GFP的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為390nlTl，發(fā)

5、射波長(zhǎng)為507nln；以咖為報(bào)告基因，利用熒光分光光度法經(jīng)初步優(yōu)化得到GFP在WB800gfp中誘導(dǎo)表達(dá)條件為：在37℃、200rpm條件下，以終濃度1％的D木糖誘導(dǎo)8h，GFP表達(dá)水平最高；上述條件下誘導(dǎo)gus、爿PPJ州、lipa基因表達(dá)，WB800一gus菌體呈現(xiàn)藍(lán)色陽(yáng)性反應(yīng)，WesternBlot試驗(yàn)結(jié)果表明WB800APPsw菌體裂解液樣品在85kDa處有明顯的陽(yáng)性蛋白雜交條帶，RashidNpNPP比色法檢測(cè)WB800一li

6、pa菌體裂解液樣品，結(jié)果顯示脂肪酶活力為7273025U／rag，較未經(jīng)木糖誘導(dǎo)的對(duì)照提高近210倍，表明三種基因都得到很好地表達(dá)；在無(wú)抗生素選擇壓力的條件下，質(zhì)粒pTL經(jīng)連續(xù)傳10代后仍表現(xiàn)出985％的高穩(wěn)定性。上述結(jié)果證明pTL是一個(gè)遺傳操作方便、穩(wěn)定性強(qiáng)、表達(dá)效率高的Ecoli丑subtilis穿梭表達(dá)載體，可以表達(dá)融合有T7肽的外源融合蛋白，不影響蛋白性質(zhì)，同時(shí)可為后續(xù)回收純化操作提供便利。2在Asubtilis的穿梭表達(dá)載體p

7、DGl48stuI的基礎(chǔ)上，經(jīng)遺傳改造構(gòu)建了一個(gè)含有Pspac啟動(dòng)子的EcoliBsubtilis穿梭載體pDGl50，將克隆的加，gus，么P風(fēng)w和lipa插入pDGl50構(gòu)建重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化丑subtil&168，獲得了重組工程菌B168gfp，B168gus，B168APPsw和B1681ipa。熒光顯微鏡觀察和熒光分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果表明GFP在B168一gfp中獲得表達(dá)，以咖為報(bào)告基因，利用熒光分光光度法證明用IPTG誘導(dǎo)B1