攜帶vgb基因枯草芽孢桿菌整合載體的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、本論文主要是研究構(gòu)建攜帶vgb基因的載體，以vegI中強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)情況和表達(dá)產(chǎn)物VHb對(duì)核黃素產(chǎn)量的影響。
　　 方法是首先選用了含spcr基因的穿梭型載體pDG1731。此載體含有ThrC5'末端和ThrC3'末端序列與枯草芽孢桿菌染色體蘇氨酸基因ThrC的5'和3'端同源，spcr基因位于同源片段中間。將啟動(dòng)子vegI和從pSK-vgb質(zhì)粒擴(kuò)增得到的vgb基因插入同源片段中間構(gòu)建得到攜帶PvegI-

2、vgb目的片段的雙交換整合型質(zhì)粒。通過(guò)Spizizen轉(zhuǎn)化將目的片段整合到產(chǎn)核黃素的B.subtilis RH44的染色體基因組中，并利用PCR等方法挑選出含目的片段的雙交換整合的轉(zhuǎn)化子，研究轉(zhuǎn)化子與B.subtilis RH44出發(fā)菌相比的核黃素產(chǎn)量的變化情況。再次選用由常用載體pUC18在HindⅢ位點(diǎn)插入spcr基因得到的pUC18-S質(zhì)粒，將目的片段PvegI-vgb插入其BamHⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)得到含有目的片段的質(zhì)粒pUC1

3、8-SVV，并通過(guò)單交換的方式整合到目標(biāo)菌B.subtilis RH44中，作為單交換的同源片段為vegI。PCR篩選出含目的片段的轉(zhuǎn)化子，LB和GM1培養(yǎng)基24小時(shí)發(fā)酵篩選出核黃素產(chǎn)量較高的轉(zhuǎn)化子菌種。利用酵母粉培養(yǎng)基在模擬的貧氧環(huán)境下發(fā)酵檢驗(yàn)新篩選的工程菌與出發(fā)菌相比核黃素產(chǎn)量的變化情況，檢驗(yàn)72h后轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌的核黃素產(chǎn)量。
　　 結(jié)果，最初構(gòu)建的雙交換整合型載體的引入造成菌體的生長(zhǎng)和代謝減緩，蛋白質(zhì)電泳發(fā)現(xiàn)vgb并未表