枯草芽孢桿菌纖維素酶基因整合載體的構(gòu)建.pdf

1、纖維素酶是一種常見的生物降解酶，能夠破壞β-1,4葡萄糖甘鍵，將纖維素降解為葡萄糖。在畜牧養(yǎng)殖方面，畜禽體內(nèi)微生物對(duì)纖維素的消化吸收效果很那達(dá)到養(yǎng)殖者的要求，但是纖維素降解后的產(chǎn)物對(duì)畜禽的身體發(fā)育卻能夠產(chǎn)生積極的效果。為了追求纖維素在畜禽生產(chǎn)中的高利用率，本試驗(yàn)構(gòu)建一株能夠降解纖維素的重組菌，對(duì)擴(kuò)大飼料原料來源具有參考意義。本試驗(yàn)選取纖維素酶 CelKg基因?yàn)槟康幕?，以野生型枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis，B.sub

2、tilis）LN基因組中 M1、M2為同源片段，以啟動(dòng)子 P43基因作為啟動(dòng)子構(gòu)建整合載體，將其轉(zhuǎn)入野生型B.subtilis LN中，以期獲得能夠高效表達(dá)纖維素酶的重組菌，并對(duì)其進(jìn)行酶活性分析。
　　主要研究如下：
　　選擇質(zhì)粒 pGEM-T Easy為載體，利用 T4連接酶將纖維素酶 CelKg基因、啟動(dòng)子 P43基因和同源片段 M1、M2連接在一起構(gòu)建重組質(zhì)粒 pGEM-Kmpgmt，將其轉(zhuǎn)化后，通過藍(lán)白斑篩選、聚合酶

3、鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）驗(yàn)證，雙酶切驗(yàn)證挑選重組大腸桿菌Kpg。
　　在野生型 B.subtilis LN感受態(tài)細(xì)胞的制備過程中，分別添加體積比為1％、2%、3%、4%和5%的吐溫-80、甲醇和丙酮，統(tǒng)計(jì)感受態(tài)細(xì)胞的復(fù)活菌數(shù)。將外源質(zhì)粒 pGEM-kmpgt通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入制備好的B.subtilis感受態(tài)細(xì)胞中，以 P4326F/P4326R為引物，利用 PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化結(jié)果，并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在野生型 B.subti

4、lis LN感受態(tài)細(xì)胞的制備過程中添加4%的甲醇，所制備的感受態(tài)細(xì)胞復(fù)活數(shù)最多為546個(gè)/μL，經(jīng)轉(zhuǎn)化后最多可獲得52個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg，轉(zhuǎn)化效率最高。
　　利用spizizen轉(zhuǎn)化法，將重組質(zhì)粒pGEM-Kmpgmt轉(zhuǎn)入野生型B.subtilis LN感受態(tài)細(xì)胞，以雙交換的形式將纖維素酶基因CelKg轉(zhuǎn)移至野生型B.subtilis LN基因組中，通過 PCR驗(yàn)證目的片段成功整合到野生型 B.subtilis LN中，獲得重組菌B.

5、subtilis Kpg。剛果紅染色結(jié)果顯示重組菌對(duì)羧甲基纖維素鈉有降解作用。通過對(duì)重組菌菌落和菌液的觀察，符合 B.subtilis菌落和菌液的形態(tài)特征。在1000×倍的顯微鏡下觀察重組菌，菌體呈桿狀，均有芽孢出現(xiàn)，和野生型B.subtilis LN形態(tài)相同。
　　對(duì)重組菌B. subtilis Kpg的最適培養(yǎng)時(shí)間、其表達(dá)的纖維素酶的最佳反應(yīng)溫度和最佳反應(yīng)環(huán)境進(jìn)行分析，結(jié)果顯示重組菌B.subtilis Kpg在37℃條件下?lián)u

6、瓶培養(yǎng)，生長(zhǎng)至18 h時(shí)上清液中纖維素酶活力最大為55.22 U/mL，與野生型 B.subtilis LN相比提高了115%。B.subtilis Kpg纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，此時(shí)纖維素酶活性最大為108.45 U/mL，反應(yīng)液pH值為6時(shí)，纖維素酶活性達(dá)到97.72 U/mL。
　　將重組菌 B.subtilis Kpg添加到麩皮中進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定其表達(dá)的纖維素酶對(duì)纖維素的實(shí)際降解能力。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組菌 B.subt