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1、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)表達(dá)和分泌的胞外脂肪酶(LipA),是分子量最小的堿性脂肪酶,有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文以提高脂肪酶分泌水平為研究目的,考查了宿主菌及胞外蛋白缺失,TatAdCd轉(zhuǎn)位酶過(guò)表達(dá)對(duì)脂肪酶發(fā)酵的影響。
在B.subtillis168中,通過(guò)缺失胞外中性蛋白酶(NprE)和堿性蛋白酶(AprE),構(gòu)建了B.subtilisBNA菌株。用脂肪酶表達(dá)質(zhì)粒pHP13L,分別轉(zhuǎn)化B.subtillis168、
2、BNA和DB104菌株,分別篩選出分泌脂肪酶的168/pHP13L、BNA/pHP13L和DB104/pHP13L菌株。搖瓶發(fā)酵顯示,B.subtillisBNA發(fā)酵液中的脂肪酶活性是168菌株的1.5倍,168菌株是DB104菌株的2.5倍。168菌株發(fā)酵液中的脂肪酶活性極不穩(wěn)定,達(dá)到最大值后迅速下降。結(jié)果表明,B.subtillis168比DB104更適宜作為脂肪酶發(fā)酵的宿主菌;主要胞外蛋白酶的缺失,有利于維持分泌脂肪酶的穩(wěn)定。
3、r> 在B.subtilisBNA和DB104菌株中,分別缺失胞外蛋白YolA、YolB、XynA、YncM和Csn,并進(jìn)行質(zhì)粒pHP13L轉(zhuǎn)化,構(gòu)建BNA和DB104系的衍生菌株BNAY2-5/pHP13L和BDY2-5/pHP13L。搖瓶發(fā)酵顯示,這些衍生菌株胞外蛋白缺失的數(shù)量與其脂肪酶發(fā)酵單位,以及發(fā)酵液中脂肪酶的穩(wěn)定性均呈正相關(guān)。缺失5個(gè)胞外蛋白的BNAY5/pHP13L和BDY5/pHP13L菌株,分別在同系菌株中,脂肪酶發(fā)
4、酵單位最高,分別為230和170 U/mL;并且脂肪酶的最大活性可持續(xù)到發(fā)酵60 h。結(jié)果表明,在產(chǎn)脂肪酶的B.subtilis中,缺失分泌量較大的依賴(lài)Sec途徑分泌的胞外蛋白,能夠在一定程度上減少Sec途徑的分泌壓力,有助于提高脂肪酶的分泌水平。
分別在B.subtilisBNA和BNAY5菌株中,在染色體sacB基因位點(diǎn),整合過(guò)表達(dá)tatAD-tatCD操縱子,構(gòu)建了B.subtilisBNAT/pHP13L和BNAY5T
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