Bt幾丁質(zhì)酶基因chi7轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、從本室分離保存的幾丁質(zhì)酶高產(chǎn)菌株蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)Bt50中提取總DNA，再根據(jù)已經(jīng)在GenBank上登錄的Bt幾丁質(zhì)酶基因chi7序列，設(shè)計(jì)出包含兩種不同的限制性?xún)?nèi)切酶的l對(duì)引物ChiF/ChiR，用PCR方法擴(kuò)增出的幾丁質(zhì)酶全長(zhǎng)基因，將PCR產(chǎn)物直接連接到pMD-18T克隆載體上轉(zhuǎn)入E.coliJMl09中克隆得到2,025bp包含氨基酸全序列的幾丁質(zhì)酶基因chi7。再根據(jù)GenBan

2、k上登錄的Bacillussubtiliasubsp.subtillsstr.168(簡(jiǎn)稱(chēng)BSl68)序列(在GenBank上的登錄注冊(cè)號(hào)為NC000964)，設(shè)計(jì)出包含兩種不同的限制性?xún)?nèi)切酶的擴(kuò)增rpsD啟動(dòng)子的1對(duì)引物RpsF/RpsR，用PCR方法擴(kuò)增出的rpsD啟動(dòng)子基因，將PCR產(chǎn)物直接連接到pMD-18T克隆載體上轉(zhuǎn)入E.coliJMl09中克隆得到380bp的rpsD啟動(dòng)子基因，命名為rpsP。然后，將幾丁質(zhì)酶基因chi7

3、和rpsD啟動(dòng)子基因rpsP連接到穿梭載體pADl23上，轉(zhuǎn)化E.coliJMl09，篩選得到重組原核表達(dá)質(zhì)粒pAD-rpsP-chi7。 將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pAD-rpsP-chi7，電激轉(zhuǎn)化到Bacillussubtilis(abbr.BS)受體菌株BS-2中，用PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒pAD-rpsP-chi7是否導(dǎo)入，最后篩選得到含有Bt幾丁質(zhì)酶基因的BS-2工程菌。初步研究表明在液體培養(yǎng)基上重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性遺傳優(yōu)于在斜面固體

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