嗜熱脂肪地芽孢桿菌脂肪酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、脂肪酶(三脂酰甘油?；饷?EC 3.1.1.3)廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中,可催化三脂酰甘油的酯鍵水解,也可催化酯化、酯交換、醇解、酸解等反應(yīng),在洗滌劑工業(yè)、食品加工、皮革造紙等方面具有廣泛應(yīng)用.近年來,來自嗜溫和嗜熱微生物的熱穩(wěn)定脂肪酶的基本性質(zhì)和工業(yè)應(yīng)用倍受關(guān)注,其中主要來源之一是2001年新命名的嗜熱脂肪地芽孢桿菌.但由于野生菌產(chǎn)脂肪酶能力低,主要研究方向集中于采用基因工程方法構(gòu)建重組菌,通過表達(dá)來獲得相應(yīng)的脂肪酶.本課題亦采

2、用此方法,在大腸桿菌中克隆并表達(dá)嗜熱脂肪地芽孢桿菌脂肪酶基因. 本文首先在由胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏、NaCl組成的培養(yǎng)基中65℃條件下培養(yǎng)野生型嗜熱脂肪地芽孢桿菌,收集菌體后采用合適的方法提取野生菌基因組作為PCR擴(kuò)增模板,Pfu酶作DNA聚合酶,擴(kuò)增得到約1.3kb條帶,與pMD18-T Simple Vector連接進(jìn)行TA克隆測(cè)序,驗(yàn)證目的基因得到正確擴(kuò)增. 表達(dá)載體pET28c(+)及TA陽性克隆用Bam

3、HⅠ、NdeⅠ雙酶切后,經(jīng)T4DNA連接酶連接構(gòu)建得到堿基數(shù)為6590bp的重組質(zhì)粒pET28c(+)-lipase,在DH5a中得到高效擴(kuò)增. 克隆成功后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E coli BL21(DE3)中表達(dá),經(jīng)SDS電泳與脂肪酶活性測(cè)定驗(yàn)證脂肪酶得到有效表達(dá).對(duì)重組菌表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,培養(yǎng)至OD600在1.0左右,加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L,28℃誘導(dǎo)6小時(shí),以橄欖油為底物,脂肪酶酶活達(dá)到1.88U/mg.