堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和短小芽孢桿菌表達(dá)載體構(gòu)建的分析.pdf

1、有益菌(Probiotics)在工業(yè)生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中已有廣泛的應(yīng)用，芽孢桿菌(Bacillus)作為益生菌中的重要組成，作為微生態(tài)制劑或生物絮團(tuán)的―添加劑‖在對(duì)蝦的規(guī)?；B(yǎng)殖中產(chǎn)生了很高的經(jīng)濟(jì)效益。在水生動(dòng)物疾病頻發(fā)的形勢(shì)下，病害微生物防控技術(shù)受到科學(xué)家的推崇，而芽孢桿菌以其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)備受青睞。本實(shí)驗(yàn)采用的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(B. firmus)和短小芽孢桿菌(B. pumilus)均分離自正常的海水環(huán)境的野生菌。為了探索利用野生型芽孢桿菌進(jìn)

2、行對(duì)蝦白斑綜合征(whit spot syndrome, WSS)防控的新途徑，分析以上兩種菌在表達(dá)載體系統(tǒng)構(gòu)建方面的應(yīng)用潛力，為選擇合適的表達(dá)載體宿主菌和構(gòu)建穩(wěn)定、高效的表達(dá)系統(tǒng)提供元件、方法。
　　本論文研究?jī)?nèi)容共包括四部分：(1)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的鑒定及其16S-23S rDNA間區(qū)多態(tài)性分析；(2)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化方法的嘗試；(3)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌p43、hag基因的克隆及堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌特異性檢測(cè)方法的建立；(4)短小芽孢桿菌應(yīng)用

3、于表達(dá)載體構(gòu)建的潛力分析。
　　1.堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的鑒定及其16S-23S rDNA間區(qū)多態(tài)性分析：利用16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析表明PC004和PC024均為B. firmus。利用16S-23S rDNA ISR PCR方法，2株B. firmus共得到11條16S-23S rDNA間區(qū)特征區(qū)帶(包括300bp、400bp、500bp和600bp等)序列，ISR類型包括ISR0、ISRG、ISRIA和ISRGLV四種

4、，其中ISR0、ISRG和ISRIA可能在B. firmus中普遍存在。相同類型的ISR序列具有較高的相似性(達(dá)52.2％-100.0%)，而不同類型的ISR序列間差異較大。此外，ISR序列在靠近16S和23S區(qū)域存在不同長(zhǎng)度的保守區(qū)域，可能成為針對(duì)B. firmus特異性檢測(cè)的引物和探針的靶區(qū)。
　　2.堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化方法的嘗試：嘗試了用Xue et al(1999)報(bào)道的方法制備B. firmus PC004感受態(tài)細(xì)胞，并

5、用pAD4412載體電轉(zhuǎn)化B. firmus，但并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的有效轉(zhuǎn)化。
　　3.堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌p43、hag基因的克隆及堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌特異性檢測(cè)方法的建立：首先，克隆了B. firmus的p43基因(431bp)。其次，簡(jiǎn)化的Leifson法(Clark,1976)成功染色B. firmus鞭毛，并確定其鞭毛為單端極生鞭毛，數(shù)量2根。再次，LC-MS/MS分析了得到了B. firmus鞭毛蛋白的18條肽段序列信息。通過(guò)FCD-PC

6、R和染色體步移獲得了鞭毛蛋白的編碼基因hag的全序列(GenBank Accession No. KC683536)。該基因全長(zhǎng)1661bp，有一個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame, orf)編碼414個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為44.2kDa，推斷hag基因啟動(dòng)子核心元件-10區(qū)和-35區(qū)被σD識(shí)別，并在其上游存在A+T富集區(qū)可能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄起始，在下游存在核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site, RBS)(

7、GGAGG)，且最后一個(gè)G與ATG間隔9nt。預(yù)測(cè)了可能具有啟動(dòng)子活性的Phag。此外，該基因含有一段B. firmus特異性肽段的編碼序列。利用I-TASSER預(yù)測(cè)了鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)模型。然后，根據(jù)特異性肽段的編碼序列設(shè)計(jì)的引物Bfspec和Bfspec2能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)B. firmus的特異性檢測(cè)，并建立了巢式PCR檢測(cè)方法。
　　4.短小芽孢桿菌應(yīng)用于表達(dá)載體構(gòu)建的潛力分析：抗生素的敏感試驗(yàn)表明該菌(201005130501)對(duì)氨

8、芐青霉素敏感。BIOLOG分析了B. pumilus對(duì)95種碳源的利用情況，該菌是淀粉和阿拉伯糖等的缺陷型。確定了B. pumilus平均傳代時(shí)間為45.51±0.11min。分離得到了B. pumilus中一隱性質(zhì)粒pBP6000(GenBank Accession No. KC683537)，是小型滾環(huán)復(fù)制型質(zhì)粒，屬于pC194家族。全長(zhǎng)5664bp，主要包括4個(gè)orf，編碼復(fù)制起始蛋白(replication initiation

9、 protein)，DNA結(jié)合蛋白(DNA-binding protein)和aspartate phosphatase response regulator等。天然質(zhì)?？梢蕴峁┹d體構(gòu)建所需要的載體骨架和元件等，增加可利用載體的資源。分離得到了短小芽孢桿菌中DNA解旋酶基因pcrA基因(GenBank No. KC683535)，PcrA解旋酶可能參與了pBP6000的復(fù)制和拷貝數(shù)的控制。但是，目前并沒(méi)有有效的途徑可以消除pBP6000

10、，十二烷基磺酸鈉(SDS)和吖啶橙(acridine orange, AO)并沒(méi)有達(dá)到消除質(zhì)粒的目的。
　　綜上所述，本研究闡述了堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌16S-23S rDNA間區(qū)的多態(tài)性，從基因水平上分析了菌株間的差異；成功克隆了B. firmus的p43和hag基因，并根據(jù)hag基因的部分核酸序列建立了B. firmus特異性檢測(cè)方法；完成了短小芽孢桿菌一個(gè)隱性質(zhì)粒的全序列測(cè)序和分析工作。此外，本研究雖未成功構(gòu)建出芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，但是