堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌抗菌代謝產(chǎn)物的研究.pdf

1、本試驗(yàn)主要是對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生條件，抗菌機(jī)制，抗菌成分進(jìn)行了較為深入的探索。 1、本試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件的研究可以看出：將CM，NYDA，LB，NB，J式培養(yǎng)基做為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行第一次篩選后，通過(guò)生物測(cè)定顯示，NB培養(yǎng)基可以作為最優(yōu)基礎(chǔ)培養(yǎng)基；然后在此基礎(chǔ)上，通過(guò)搖瓶正交試驗(yàn)分析了不同碳、氮源以及溫度、pH、溶氧量對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌產(chǎn)代謝產(chǎn)物影響的顯著性差異，最終確定了最佳培養(yǎng)基配方和最優(yōu)生長(zhǎng)條件為牛肉膏8g，蛋白胨10

2、g，葡萄糖14g；最優(yōu)生長(zhǎng)條件為PH值7.5，溶氧量取150 ml培養(yǎng)液于300 ml三角瓶中振蕩培養(yǎng)，最適溫度為35℃。經(jīng)最優(yōu)培養(yǎng)基培養(yǎng)Bacillius.firmus后分離到的無(wú)菌代謝產(chǎn)物對(duì)指示菌的抑菌率達(dá)到79％以上，且在病原菌培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)不產(chǎn)生分生孢子。通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)曲線和代謝產(chǎn)物抗菌活性曲線的測(cè)定結(jié)果表明，在培養(yǎng)60小時(shí)時(shí)，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的菌量和代謝產(chǎn)物的抗菌活性達(dá)到最大；一般來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)時(shí)間不能超過(guò)72小時(shí)，因?yàn)榇藭r(shí)無(wú)論是菌量的多少或

3、是代謝產(chǎn)物的產(chǎn)出都開(kāi)始進(jìn)入衰退期，不利于代謝產(chǎn)物的提取與利用。 2、通過(guò)抗菌代謝產(chǎn)物對(duì)指示菌枯斑擬盤多毛孢菌絲與分生孢子的作用可以看出，該抗菌物質(zhì)的作用機(jī)制主要是以溶菌和拮抗作用為主。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該代謝產(chǎn)物可以使病原菌菌絲顏色加深，壁加厚，菌絲隔膜增加，每一段形狀變?yōu)槟钪闋罨驒E圓形，以菌絲分枝變形最為嚴(yán)重，大多數(shù)膨大為囊狀，內(nèi)部形成球狀顆粒，甚至破碎、裂解，內(nèi)部原生質(zhì)溢出，使菌絲變?yōu)榭諝?。使病原菌的分生孢子不萌發(fā)，胞壁明顯變薄

4、，特別是萌發(fā)胞，首先是開(kāi)始膨大，細(xì)胞壁較其他兩節(jié)細(xì)胞薄，然后完全變成泡囊狀：有些分生孢子的第一節(jié)細(xì)胞也同時(shí)膨大為泡囊狀，細(xì)胞壁很薄；在代謝產(chǎn)物處理48小時(shí)后，分生孢子的萌發(fā)胞普遍破裂，第一節(jié)細(xì)胞壁也陸續(xù)裂解，內(nèi)部原生質(zhì)外溢。抗菌譜的試驗(yàn)結(jié)果表明，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的抗菌代謝產(chǎn)物具有廣譜高效的抗菌作用，針對(duì)各種各樣的病原真菌都有很明顯的抑制作用。除了對(duì)接合菌亞門的總狀毛霉沒(méi)有抗菌活性以外，對(duì)所有應(yīng)試病原菌都顯示出一定的抗菌活性。其中，對(duì)子囊菌亞

5、門的核盤菌抗菌效果最佳，病原菌在含藥平板上完全不生長(zhǎng)；對(duì)半知菌亞門的桂花爛皮菌抑菌效果最差，但是抑菌率也達(dá)到了40％以上。 3、試驗(yàn)通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀法，透析法，離子交換層析法，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺疑膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)抗菌代謝產(chǎn)物的基本性質(zhì)和分子量做了深入探索。試驗(yàn)結(jié)果顯示，代謝物質(zhì)在不同飽和度的硫酸銨作用下，都會(huì)不同程度的產(chǎn)生沉淀，沉淀比重較小，漂浮于液面，棕色，隨著硫酸銨飽和度越大，得到的蛋白質(zhì)抗菌活性和蛋白質(zhì)

6、含量同時(shí)增大，但是當(dāng)硫酸銨飽和度到達(dá)70％時(shí)，抗菌活性與蛋白質(zhì)含量到達(dá)頂峰。該沉淀物質(zhì)經(jīng)透析后仍然具有抗菌活性，對(duì)紫外線和氯仿基本穩(wěn)定，對(duì)高溫和酸的耐受性不強(qiáng)，對(duì)胰蛋白酶不敏感，對(duì)蛋白酶K部分敏感。以離子交換層析后分離出三個(gè)峰的樣品，通過(guò)生物測(cè)定確定僅有一個(gè)峰的樣品具有抗菌活性，SDS-PAGE后，結(jié)果表明只有具有生物活性的樣品產(chǎn)生了一條清晰的譜帶，但顏色較Marker淡。經(jīng)過(guò)將譜帶的位置與Protein Marker，middle所形