短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化研究.pdf

1、綠色熒光蛋白(GFP)基因作為標(biāo)記基因,被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物學(xué)方面,由于其表達(dá)穩(wěn)定,容易觀測(cè),因此,也可以作為啟動(dòng)子活性的報(bào)告基因.為了進(jìn)一步優(yōu)化短小芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng),以GFP作為報(bào)告基因,對(duì)克隆自DX01菌株的啟動(dòng)子進(jìn)行了一系列的研究.采用PCR技術(shù),亞克隆來自短小芽孢桿菌(Bacillus brevis)DX01菌株總基因組中的啟動(dòng)子活性片段F1,分別構(gòu)建了大腸桿菌組成型表達(dá)載體pUC118-F1gfp和一個(gè)大腸桿菌-短小芽孢桿菌

2、穿梭表達(dá)載體pHY300-F1gfp,以缺失啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白(GFP)基因?yàn)閳?bào)告基因,檢測(cè)了該片段在大腸桿菌DH5α和短小芽孢桿菌DX01菌株中的啟動(dòng)活性,在熒光顯微鏡下,均觀察到了明亮的綠色熒光,證實(shí)活性片段F1具有組成型啟動(dòng)子的功能,gfp基因?qū)?種宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了組成型表達(dá).該表達(dá)結(jié)果為Western印跡所證實(shí).對(duì)2種宿主表達(dá)細(xì)胞中GFP蛋白的表達(dá)量作了FACS分析,結(jié)果表明gfp基因在DX01細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度約為DH5α中的

3、2倍.運(yùn)用來自噬菌體Mu的轉(zhuǎn)座酶MuA,對(duì)啟動(dòng)子F1進(jìn)行了隨機(jī)插入突變,從中篩選出13個(gè)F1的突變體.對(duì)突變體的氯霉素抗性檢測(cè)表明,與F1對(duì)照相比,7個(gè)含相應(yīng)突變體的菌株其氯霉素抗性水平有顯著提高,其中突變體Fm3和Fm10抗性提高了3.6倍,可抗高達(dá)900μg/mL氯霉素,揭示這些啟動(dòng)子突變體有著更高的啟動(dòng)活性;4個(gè)突變體氯霉素抗性水平下降;2個(gè)突變體抗性水平基本不變.CAT-ELISA檢測(cè)的結(jié)果,也進(jìn)一步證實(shí)了氯霉素抗性水平的變化與

4、CAT酶活力的變化有著密切的關(guān)系.在啟動(dòng)子F1的DNA序列上,存在著不同插入效應(yīng)敏感位點(diǎn),在這些位點(diǎn)附近的插入突變,可使啟動(dòng)活性急劇變化,并且相鄰的插入位點(diǎn),其突變效應(yīng)可能完全不同.FACS分析表明,在大腸桿菌中表現(xiàn)為啟動(dòng)活性增強(qiáng)的F1突變體,轉(zhuǎn)入短小芽孢桿菌DX01后其活性仍表現(xiàn)為增強(qiáng).采用RT-PCR方法,克隆了蘿卜抗真菌蛋白1(Rs-AFP1)的cDNA全長(zhǎng),在該基因的上游連上了一個(gè)短小芽孢桿菌47株的中壁蛋白(MWP)信號(hào)肽,將