短小芽孢桿菌BS-4菌株對大豆疫病的生防作用及其機制研究.pdf

1、由大豆疫霉（Phytophthora sojae）引致的大豆疫病是一種嚴重威脅大豆生產(chǎn)的病害，每年給大豆生產(chǎn)帶來嚴重損失。本文聚焦大豆疫病的生物防治，在對大豆疫霉拮抗細菌分離、鑒定、抑菌譜測定及發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，研究了短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）BS-4菌株及其代謝產(chǎn)物對大豆疫病的生防作用及其機制。主要研究結(jié)果如下：
　　1大豆疫霉拮抗菌的分離、鑒定及生理生化特性研究
　　從安徽懷遠大豆田塊土壤中分離

2、到1株對大豆疫霉具有強烈抑制作用的拮抗細菌BS-4。采用CTAB法提取BS-4菌株的總DNA，通過對其16S rDNA序列分析，進行了分子鑒定，并測定了其菌落形態(tài)及生理生化特性。同時還研究了溫度、pH、培養(yǎng)時間和不同碳氮源對其生長的影響。結(jié)果顯示，生防菌BS-4的16S rDNA序列片段大小為1416 bp，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的短小芽孢桿菌Bacillus pumilus strain Y58（序列號：EF203211.1）

3、的同源性為89％；同時生理生化性質(zhì)測定結(jié)果顯示，BS-4與短小芽孢桿菌的生理生化特征極其相似，據(jù)此將BS-4鑒定為短小芽孢桿菌（B. pumilus）。BS-4菌落初始呈圓形、淡黃色、半透明、表面光滑，培養(yǎng)后期其菌落顏色加深、透明度下降、表面凹凸不平出現(xiàn)褶皺、邊緣不規(guī)則；BS-4菌株的生長受到溫度、pH、培養(yǎng)時間和不同碳、氮源的影響，其適宜生長溫度為20～45℃，最適生長溫度為37℃；同時它能在pH為7～9的范圍內(nèi)快速生長，能夠適應(yīng)弱堿

4、性的環(huán)境，其生長周期約為72 h。BS-4菌株能夠利用多種碳源和氮源，以在含有麥芽糖和NH4Cl的培養(yǎng)基中生長最好。
　　2生防菌BS-4抑菌譜的測定
　　分別測定了生防菌BS-4菌株對15種病原真菌和8種疫霉菌的拮抗作用及其代謝液對不同病原菌的抑制作用。結(jié)果表明，BS-4菌株對不同病原菌的抑制作用具有差異性，其中BS-4菌株對核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、灰葡萄孢（Botrytis ciner

5、ea）具有強烈的抑制作用，抑制率均在70%以上；對稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）、燕麥鐮孢（Fusarium avenaceum）、黃色鐮孢（F. culmorum）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）和串珠鐮孢（F. moniliforme）具有中等抑制作用，抑制率在41.67～50.89%之間；對蘋果炭疽病菌（Co

6、lletotrichum gloeosporioides）、雪腐鐮孢（F. nivale）、尖孢鐮孢（F. oxysporum）和大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）具有弱的拮抗作用，而對腐皮鐮孢（F. solani）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）幾乎沒有拮抗作用；BS-4菌株除了對辣椒疫霉（P. capsic）的拮抗作用較弱外，對其他疫霉菌均在50%以上。BS-4菌株的代謝液對不同病原菌的抑制作

7、用同樣存在差異，其中對核盤菌、灰葡萄孢、禾谷絲核菌（R. cerealis）、小麥全蝕病菌和立枯絲核菌抑制率為100%，對串珠鐮孢和黃色鐮孢的抑制率與對峙試驗相比顯著下降；代謝液對疫霉菌具有明顯的抑制作用。
　　3生防菌BS-4發(fā)酵條件的優(yōu)化
　　分別測定了碳、氮源、無機鹽對其發(fā)酵液生物活性的影響，采用正交試驗法測定了其發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配比；同時還測定了發(fā)酵溫度、pH、接菌量、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時間等發(fā)酵條件對代謝液生物活性的影

8、響。結(jié)果表明，生防菌BS-4能利用果糖、木糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、乳糖作為碳源，其中麥芽糖作為碳源產(chǎn)生的發(fā)酵液對大豆疫霉的抑制作用最好，抑制率達到了70.03%；試驗還發(fā)現(xiàn)， BS-4在NH4Cl條件下產(chǎn)生的代謝液對大豆疫霉具有良好的抑制作用，另外還發(fā)現(xiàn)， KH2PO4能顯著提高代謝液的抑菌活性。培養(yǎng)基配比正交試驗表明，麥芽糖：NH4Cl：KH2PO4：胰蛋白胨比例為4：2：3：1時代謝液的抑制作用最明顯，對大豆疫霉菌

9、絲抑制率達到了71.42%，對不同配比的培養(yǎng)基進行比較發(fā)現(xiàn)，當C/N為4：3時產(chǎn)生的代謝液具有較高的抑制活性。發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果表明：BS-4在pH為7-9之間的培養(yǎng)基，接菌量為2%，搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm，培養(yǎng)溫度為30℃時，發(fā)酵4-5 d其產(chǎn)生的代謝液生物活性最高。
　　4生防菌BS-4發(fā)酵液的理化性質(zhì)及對大豆疫霉的抑制作用
　　分別研究了生防菌BS-4發(fā)酵條件經(jīng)優(yōu)化后代謝的理化性質(zhì)及對大豆疫霉的抑制作用。結(jié)果顯示，發(fā)

10、酵液不同使用濃度對大豆疫霉的抑制作用存在差異，使用濃度與抑菌率之間存在線性關(guān)系；經(jīng)不同溫度處理后，對大豆疫霉仍具有生物活性，具有熱穩(wěn)定性；pH值影響了代謝液的生物活性，其最適pH值為8.0，代謝液能夠適應(yīng)pH7.0～9.0的弱堿性環(huán)境；不同生物酶處理過后，代謝液仍能保持活性，說明其產(chǎn)物可能是脂肽類化合物。代謝液對大豆疫霉菌絲的產(chǎn)量具有顯著的抑制作用，代謝液處理過后，菌絲鮮重和干重嚴重下降；同時還能抑制游動孢子的萌發(fā)和芽管的伸長以及卵孢子

11、的形成和大小。
　　5生防菌BS-4對大豆疫霉侵染及大豆植株體內(nèi)抗病酶系活性的影響
　　測定了生防菌BS-4及其代謝液對大豆疫霉侵染大豆葉片及植株的抑制作用，同時還研究了生防菌BS-4處理大豆植株后，大豆植株體內(nèi)與抗病性相關(guān)的PAL、POD和PPO的活性變化。結(jié)果顯示，大豆疫霉的游動孢子和菌絲體在生防菌處理的葉片上的侵染受到明顯影響，游動孢子在BS-4菌液前處理和后處理的葉片上均不能侵染，菌絲在前處理的葉片上不能侵染而在后處

12、理的葉片上能輕微侵染。生防菌處理大豆植株后進行挑戰(zhàn)接種大豆疫霉，結(jié)果顯示，經(jīng)生防菌BS-4處理后，大豆疫霉在接種部位僅能輕微發(fā)病，病斑不能擴展，植株生長良好，而對照組大豆嚴重發(fā)病，接種6d后植株死亡。同時還發(fā)現(xiàn)，生防菌處理后再挑戰(zhàn)接種大豆疫霉，植株體內(nèi)的PAL、POD和PPO三個與抗性相關(guān)的酶類活性發(fā)生變化，接種3d后三種酶的活性均達到頂峰，隨后開始下降，到接種6 d時又有所上升，但幅度不大；同時還發(fā)現(xiàn)，生防菌BS-4單獨處理過后，植株

13、體內(nèi)的PAL和POD活性能夠顯著上升，并能持續(xù)到第4d，而PPO的活性升高不明顯。這些結(jié)果說明生防菌BS-4誘導(dǎo)植物抗性是防治大豆疫霉的機理之一。
　　6生防菌BS-4在大豆植株的定植及對根圍微生物的影響
　　測定了生防菌BS-4在大豆葉片及根際周圍的定殖及對土壤微生物種群的影響。結(jié)果表明：生防菌BS-4能夠在大豆葉片上定植，但持效期較短，僅能維持11d；接種7d后，在葉片上分離到的菌落數(shù)僅為8.0×105cfu/g，接種1

14、1 d后幾乎檢測不到生防菌BS-4的存在；但是生防菌BS-4在土壤中具有良好的生存能力，接種1 d后菌落數(shù)目出現(xiàn)一個高峰，之后逐漸降低當接種5d后，其菌落數(shù)目達到穩(wěn)定，之后菌落數(shù)目穩(wěn)定在107數(shù)量級，上下略有浮動，但變化不大。同時生防菌BS-4接種后，對土壤中的真菌和細菌有一定的影響，真菌數(shù)目在接種初期有所下降，接種10 d后又有所回升；細菌數(shù)目在接種初期急劇上升，但在接種后期又趨于穩(wěn)定；生防菌BS-4對放線菌的影響不大，其菌落數(shù)目未出