短小芽孢桿菌β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶的基因克隆、高效表達(dá)及定向進(jìn)化研究.pdf

1、堿性纖維素酶是在堿性條件下可發(fā)揮催化作用的β—1，4—葡聚糖內(nèi)切酶，可廣泛應(yīng)用于洗滌劑，生物化工等方面。但由于堿性纖維素酶的酶活力普遍較低，其應(yīng)用受到了很大的限制。本課題通過篩選得到了高活力的堿性纖維素酶產(chǎn)生菌；克隆了其β—1，4—葡聚糖內(nèi)切酶基因并在大腸桿菌中進(jìn)行了高效的表達(dá)；應(yīng)用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)β—1，4—葡聚糖內(nèi)切酶的催化效率進(jìn)行了定向進(jìn)化研究，利用高通量的篩選方法，篩選到了催化效率提高的突變酶。本課題的主要研究結(jié)果如下：

2、(1)利用水解圈和菌落直徑比大小進(jìn)行初篩和酶活力測(cè)定復(fù)篩相結(jié)合的方法從幾十個(gè)土樣中分離到了兩株活力較高的堿性纖維素酶產(chǎn)生菌H9和H12，菌株H9搖瓶發(fā)酵產(chǎn)CMC的酶活力可以達(dá)到2.06U/mL。酶的最適合催化溫度為55℃，最適合催化pH為8.0，對(duì)溫度和pH具有良好的穩(wěn)定性。 (2)通過形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)，16S rRNA基因序列等實(shí)驗(yàn)，鑒定兩菌株為短小芽孢桿菌?；贕eneBank中與其16S rRNA基因序列同源性較高的模式

3、菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明兩菌株均與短小芽孢桿菌的關(guān)系最近，進(jìn)一步證明了兩菌株為短小芽孢桿菌。 (3)利用PCR方法擴(kuò)增出了兩菌株的DNA序列條帶，酶基因序列分析表明：兩菌株的β—1，4—葡聚糖內(nèi)切酶基因編碼序列均由1980個(gè)堿基組成，酶分子由659個(gè)氨基酸組成，預(yù)計(jì)分子量為73KD左右。將該序列與GeneBank中已報(bào)道的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明與已報(bào)道的短小芽孢桿菌所S-27及枯草芽孢桿菌KSM—522所編碼的葡聚糖

4、內(nèi)切酶具有較高的同源性，將兩基因序列分別提交GeneBank，序列接受號(hào)分別為EF501975，EF620915。 (4)酶的結(jié)構(gòu)域分析顯示酶由兩個(gè)不連續(xù)結(jié)構(gòu)域組成的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，其一為N—端催化結(jié)構(gòu)域，由糖基水解酶家族9組成，該結(jié)構(gòu)域主要起催化底物水解的作用；第二個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)镃—端底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)域家族3組成，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間由一段連接序列連接?；谝患?jí)結(jié)構(gòu)氨基酸順序分析顯示蛋白的N—端催化結(jié)構(gòu)域主要由α螺旋結(jié)構(gòu)組

5、成，而C—端結(jié)合結(jié)構(gòu)域主要由β折疊結(jié)構(gòu)域組成。 (5)以重組載體pMD18—EglA為模扳，亞克隆得到EglA基因，基因片段用BamHI和XhoⅠ雙酶切，構(gòu)建到同樣用Bam HI和XhoⅠ雙酶切處理的表達(dá)載體pET20b中，獲得重組表達(dá)載體pET20—EglA。將重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組大腸桿菌菌株BL21(DE3)/pET20b-EglA。將重組大腸桿菌接入三角搖瓶進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)加

6、入誘導(dǎo)物IPTG，然后培養(yǎng)一定時(shí)間取樣測(cè)定酶活力，其細(xì)胞外酶活力可以達(dá)到3.51U/mL。 (6)重組大腸桿菌菌株發(fā)酵液的SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)果表明重組大腸桿菌菌株具有73KD左右的蛋白質(zhì)分泌條帶，分子量大小與理論值相一致。 (7)利用陽性轉(zhuǎn)化子可以在LB-CMC平板上面可以產(chǎn)生透明圈的原理，為了減少工作量，根據(jù)轉(zhuǎn)化子在LB-CMC平板上產(chǎn)生水解圈的大小進(jìn)行初篩，對(duì)初篩菌株酶活力測(cè)定進(jìn)行復(fù)篩，經(jīng)過一輪易錯(cuò)PCR，

7、從轉(zhuǎn)化子中篩選到了一株酶活力提高的突變菌株，結(jié)果顯示突變酶活力大約是重組酶活力的1.32倍，而突變酶的表達(dá)量比重組酶的提高了5％，這說明突變酶的催化效率確實(shí)得到了提高，突變酶的催化效率約為野生酶的1.26倍。基因測(cè)序結(jié)果表明有3個(gè)堿基發(fā)生了突變，突變導(dǎo)致酶的氨基酸序列中2個(gè)氨基酸發(fā)生了改變：其中野生酶突變位點(diǎn)的密碼子AAA(106bp)位點(diǎn)突變?yōu)榱薌AA，其編碼的氨基酸由賴氨酸變?yōu)榱藶楣劝彼?；其中野生酶突變位點(diǎn)的密碼子TTT(1760b