巨大芽孢桿菌L--天冬酰胺酶基因的克隆表達及定向進化.pdf

1、L-天冬酰胺酶(L-Asparaginase，EC3.5.1.1)能專一催化水解L-天冬酰胺脫氨基生成L-天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶不僅廣泛應(yīng)用于急性淋巴細胞白血病(ALL)、惡性淋巴瘤(ML)、霍奇金淋巴瘤(HL)等疾病的治療，而且用于控制高溫油炸、烘焙食品中丙烯酰胺的形成而不影響產(chǎn)品的外觀、味道。目前L-天冬酰胺酶普遍存在穩(wěn)定性差、酶活低、pH適用范圍窄等問題，限制了其在食品加工中的應(yīng)用。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)新型的L-天冬酰胺酶具有深

2、遠理論意義和潛在的應(yīng)用價值。
　　本文針對以上問題，從土壤中篩選分離到一株高效產(chǎn)L-天冬酰胺酶菌株H-1，對其進行了形態(tài)特征、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定，并對其編碼L-天冬酰胺酶基因ansA、ansZ進行了克隆和異源表達，以及對表達產(chǎn)物提純和重組酶的酶學(xué)性質(zhì)作了初步探討。同時，對L-天冬酰胺酶的定向進化及其在油炸薯條中的應(yīng)用進行了研究。主要研究結(jié)果分述如下。
　　1.L-天冬酰胺酶產(chǎn)生菌的篩選與鑒定。采用酚紅/BTB初篩平

3、板篩選到100余株L-天冬酰胺酶產(chǎn)生菌，并通過搖瓶復(fù)篩，從江蘇省某天冬酰胺生產(chǎn)企業(yè)排放污水口土壤中篩選一株具有較高酶活的菌株H-1，酶活達0.086+0.0023 IU/mL。對菌株H-1進行菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定及分子生物學(xué)鑒定，確定菌株H-1為巨大茅孢桿菌(Bacillusmegaterium)。
　　2.B.megaterium L-天冬酰胺酶的克隆與表達。根據(jù)Genbank中B.megateriumWSH-002的全基

4、因組序列成功克隆出B.megaterium H-1 L-天冬酰胺酶基因ansA(1050bp)、ansZ(1113 bp)序列，分別編碼349與370個氨基酸蛋白。酶基因分別與表達載體pET-30a，pET-32a連接，成功構(gòu)建了四個重組表達載體，實現(xiàn)L-天冬酰胺酶基因ansA、ansZ在Escherichia coli中異源表達，其中催化活力最高的pET-30a-BM-ansZ重組菌，經(jīng)表達條件優(yōu)化后酶活達4.26±0.22 IU/m

5、L，較野生菌的酶活提高約50倍，將該重組酶命名為BmAase。
　　3.BmAase的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究。表達產(chǎn)物通過Ni親和柱進行一步純化，BmAase比活達到146.48U/mg（谷氨酰胺活性可忽略不計）;SDS-PAGE分析與MALDI-TOF-MS檢測出其分子量為39.628 kDa。BmAase的最適催化反應(yīng)條件為40?！?，pH7.0, BmAase具有一個相對較寬的pH活性范圍pH5.0-8.0，熱穩(wěn)定性好，60

6、℃/70℃處理12 h仍分別保留70％/55％以上相對活力;BmAase動力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km為0.8 mM，最大反應(yīng)速度Vmax為1.58 IU/μg。
　　4.B.megaterium L-天冬酰胺酶的定向進化。摸索易錯PCR反應(yīng)體系，按Mg2+、Mn2+濃度分別為2mM、0.06mM進行易錯PCR反應(yīng)。利用建立的基于96微孔板高通量篩選模型，經(jīng)過2輪易錯PCR，從8000多個突變株中篩選出酶活最高的突變株2MH6，其比活力為

7、188.69 IU/mg，較BmAase提高約30％。以易錯PCR篩選得到的突變體作為親本進行DNA Shuffling，從5000多個突變株中篩選到突變株S-CA3，其比活力達到249.01 IU/mg，較BmAase提高70％，且該酶在pH5.0-9.0保持活力穩(wěn)定，拓寬了堿性pH反應(yīng)范圍。
　　5.L-天冬酰胺酶在油炸薯條中的應(yīng)用。油炸前用L-天冬酰胺酶處理土豆條，通過HPLC-MS檢測油炸薯條中丙烯酰胺含量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)L-天冬